[發(fā)明專利]一種定點(diǎn)突變的Lambda噬菌體Int重組蛋白及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410046915.6
• 申請日: 2014-02-10
• 公開（公告）號: CN103740684A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張瑋;溫華杰;李春園;蒙偉能;王文忠;施金秀
• 申請（專利權(quán)）人: 賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及活性位點(diǎn)突變的Lambda噬菌體Int重組蛋白及其在溫度控制下DNA重組反應(yīng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

Int蛋白來源于Lambda噬菌體（又稱Lambda噬菌體），其在Lambda噬菌體DNA整合到宿主基因組DNA中具有重要作用。與IHF和Xis一同，作為Lambda噬菌體DNA與宿主基因組DNA整合與釋放的關(guān)鍵蛋白因子。

Lambda噬菌體在其生活史上，需要通過感染宿主細(xì)菌，通過整合、復(fù)制和釋放其自身DNA的方式完成其生活史。整合與釋放都需要借助于系列存在基因組DNA上的att核酸位點(diǎn)和IHF、Int和Xis蛋白。根據(jù)Lambda噬菌體同源重組的生活史，從大腸桿菌中分離出IHF基因并開展蛋白原核表達(dá)，從Lambda噬菌體基因組中分別分離出Int基因并開展蛋白原核表達(dá)。通過混合和調(diào)節(jié)IHF和Int蛋白比例進(jìn)行體外BP反應(yīng)。因該重組反應(yīng)具備特定att核酸位點(diǎn)，因此重組效率較高。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用到載體構(gòu)建工作中。因其具備的高效重組和位點(diǎn)特異性重組，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白大樣本表達(dá)和篩選，基因遺傳多樣性分析，活性蛋白篩選等多種生物技術(shù)工作中。

目前BP反應(yīng)在適宜溫度條件下受溫度影響小，在較低溫度下BP反應(yīng)也能進(jìn)行。因此，不能夠通過溫度差異影響酶的重組活性。不利于開展大樣本重組反應(yīng)，限制高通量載體構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種重組蛋白，在達(dá)到特定溫度條件下，啟動BP重組活性。

本發(fā)明提供的定點(diǎn)突變的Lambda噬菌體Int重組蛋白，由Lambda噬菌體Int的重組蛋白基因片段定點(diǎn)突變獲得。

優(yōu)選的，重組蛋白由Lambda噬菌體Int全長基因的347位和351位氨基酸突變獲得。

優(yōu)選的，重組蛋白為G347H和D351H突變的Lambda噬菌體Int重組蛋白。

優(yōu)選的，重組蛋白具有與野生型Lambda噬菌體Int蛋白酶一致的重組活性。

優(yōu)選的，重組蛋白在15～37℃具有酶活熱穩(wěn)定性。

優(yōu)選的，重組蛋白在25℃具有酶活熱穩(wěn)定性。

優(yōu)選的，重組蛋白在25℃具有溫度敏感的高生物活性。

本發(fā)明同時提供了一種重組蛋白在核酸重組系統(tǒng)中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供了一種重組蛋白通過溫度差異調(diào)控核酸重組系統(tǒng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明同時提供一種定點(diǎn)突變的Lambda噬菌體Int重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：

1）設(shè)計含有突變位點(diǎn)的Int特異性引物；

2）克隆野生型Lambda噬菌體Int基因；

3）以野生型Lambda噬菌體Int基因為模板，在Int特異性引物的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得定點(diǎn)突變的Lambda噬菌體Int重組基因；

4）采用限制性內(nèi)切酶，分別酶切質(zhì)粒載體和所述的Lambda噬菌體Int重組基因；

5）采用DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有所述的Lambda噬菌體Int重組基因的重組質(zhì)粒；

6）對步驟5）得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，然后通過分離、純化，得到所述重組蛋白。

通過將Lambda噬菌體Int改造成受溫度影響而發(fā)揮活性的重組蛋白。使得該重組蛋白在低溫條件下不啟動DNA重組反應(yīng)，在一定溫度條件下啟動DNA重組反應(yīng)，從而可以控制DNA重組反應(yīng)。通過溫度差異影響酶的重組活性，可以開展大樣本重組反應(yīng)，提高重組樣本通量。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡要介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1示出本發(fā)明的Int重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況示意圖；

圖2示出不同溫度條件下BP反應(yīng)克隆菌落柱狀圖；

圖3示出突變型Int重組蛋白和野生型Int蛋白酶重組活性對比柱狀圖。

具體實(shí)施方式

以下將參考附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的各種示例性實(shí)施例、特征和方面。附圖中相同的附圖標(biāo)記表示功能相同或相似的元件。盡管在附圖中示出了實(shí)施例的各種方面，但是除非特別指出，不必按比例繪制附圖。

在這里專用的詞“示例性”意為“用作例子、實(shí)施例或說明性”。這里作為“示例性”所說明的任何實(shí)施例不必解釋為優(yōu)于或好于其它實(shí)施例。