[發明專利]一種從白色霞水母觸手中分離毒素蛋白的方法

有效

• 申請號: 201410042858.4
• 申請日: 2014-01-29
• 公開（公告）號: CN103739694A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 李鵬程;薛偉;于華華;李榮鋒;邢榮娥;劉松;秦玉坤;陳曉琳;胡林峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說是一種從白色霞水母觸手中分離致血管通透性增大的毒素蛋白的方法

背景技術

白色霞水母(Cyanea?nozakii?Kishinouye)是我國沿海常見的災害性水母，觸手有大量的刺細胞，在受到刺激后可釋放毒素，每年有大量的游客，漁民被蜇傷，受害者出現皮膚紅腫，刺痛，甚至過敏死亡，因此深入研究水母毒素對水母蟄傷的防治有著重要的現實意義。水母毒素主要是蛋白類物質，其活性包括酶活性，溶血活性，肝毒性，心血管活性，致死活性，皮膚致炎活性等等。目前水母毒素研究面臨的難點之一是毒素收集困難，多采用破碎刺細胞的方法進行毒素的提取，操作繁瑣，耗時長，毒素不穩定易降解，且引入大量雜蛋白不利于進一步的分離純化。

發明內容

本發明目的在于提供一種從白色霞水母觸手中分離致血管通透性增大的毒素蛋白的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種從白色霞水母觸手中分離毒素蛋白的方法，

1)首先制備水母粗毒:將新鮮超低溫冷凍的白色霞水母觸手于含NaCl的預冷緩沖液中，攪拌融化，低溫離心，收集上清液，濃縮得到水母粗毒。

2）將步驟1）得到的水母粗毒經微孔濾膜過濾后，用離子色譜柱DEAESepharose?Fast?Flow（2.6x10cm）分離，采用分步洗脫，流速為1-3ml/min,收集900-1080ml段的洗脫液于0～6℃下用3～10K的超濾管進行濃縮；

洗脫液為含不同濃度NaCl的pH7.0～7.4Tris-HCl；

3)將步驟2）得到的濃縮液用凝膠色譜柱SephadexG-200（1.6x70cm）進行分離，以含NaCl的pH7.0～7.4Tris-HCl作為洗脫液，在0.3-0.5ml/min的流速下洗脫,收集90-120ml洗脫液，0～6℃下用3～10K的超濾管進行濃縮，得到毒素活性蛋白CnP45。

所述步驟1）白色霞水母粗毒的制備，取超低溫冷凍的白色霞水母觸手，0～6℃下加入觸手0.5～4倍重量（m/m）的含0.1～0.3mol/L?NaCl的10～30mmol/L,pH7.0～7.4Tris-HCl緩沖液，攪拌至觸手融化，0～6℃下8000～15000g離心5～20min,收集上清緩沖液，0～6℃下用3～10K的超濾管進行濃縮。

所述步驟1）觸手冷凍的溫度為－80～－20℃，冷凍時間在24h以上。

所述步驟2）將步驟1）所得到的粗毒濃縮液過濾所用微孔濾膜孔徑為0.45μm。

所述步驟2）和步驟3）的色譜柱分離均在0～6℃下進行。

將上述各步驟所得濃縮以及最終產物分別進行SDS-PAGE電泳檢測其分子量和純度；同時各步驟所得濃縮以及最終產物用伊文思藍法檢測所得毒素蛋白對小鼠背部血管通透性影響，

伊文思藍法檢測，具體方法如下：

將6只昆明鼠隨機分為2組，每組3只。實驗前1d，用8%硫化鈉將小鼠背部脫毛。配制0.5%伊文思藍溶液，由尾靜脈注射伊文思藍溶液5ml/Kg，5min后，空白對照組背部皮下注射0.1～0.3mol/L?NaCl,10～30mmol/L,pH7.0～7.4Tris-HCl緩沖液200μL，實驗組注射分離毒素蛋白200μL（0.893mg/ml），120min后，小鼠脫臼處死，取注射部位皮膚，觀察伊文思藍滲漏情況。剪取注射部位皮膚，各稱取0.30g，剪碎后加入丙酮-生理鹽水（7:3）溶液5ml，浸泡48h后離心（3000r/min，10min），取上清液，測定波長610nm處吸光度值（A），以檢測尹文思藍滲出量。實驗結果顯示實驗組背部皮膚較空白對照組有明顯的伊文思藍滲出，A₆₁₀值亦明顯高于空白對照組，證明此蛋白有致血管通透性增大的活性。

本發明的優點：

本發明采用將超低溫冷凍水母觸手加入緩沖液解凍，收集緩沖液制備水母毒素的方法，無需破壞刺細胞，簡化了毒素提取的過程，減少了非毒素雜蛋白的混入，有利于之后的蛋白分離純化，且超低溫環境有利于毒素活性的保持，為更好的研究水母毒素蛋白提供了重要方法指導。

進而采用本發明方法收集水母毒素，無需破壞刺細胞，簡化了水母毒素提取步驟，提高了毒素純度，有利于進一步的分離純化；同時分離得到白色霞水母中致血管通透性增大的毒素蛋白，為進一步研究此蛋白及作用機理奠定了基礎。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的超低溫處理前后觸手刺細胞顯微照片。