[發明專利]一種檢測TERT單核苷酸多態性的方法

無效

• 申請號: 201410042839.1
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103923976A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 吳松;蔡志明
• 申請（專利權）人: 吳松;蔡志明
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 深圳市合道英聯專利事務所(普通合伙) 44309
• 代理人: 廉紅果;謝成毅

技術領域

本發明屬于生物技術分子檢測技術領域，具體涉及一種檢測TERT單核苷酸多態性的方法。

背景技術

膀胱癌是排在第九位的全球最常見的腫瘤。2013年,在美國有超過73000名患者被診斷為膀胱癌，其中死亡人數約15000人。其中超過90%的患者最初診斷為原發性膀胱癌，大約75%的患者目前為表淺膀胱腫瘤,20%的為浸潤性膀胱腫瘤,剩下的5%初診為轉移性腫瘤。先前的研究表明,膀胱癌有著多變的臨床表現和遺傳背景。最近的膀胱腫瘤研究報道了8個相關基因(UTX,MLL-MLL3,CREBBP-EP300,NCOR1,ARID1A,CHD6)。

目前檢測“膀胱癌”采用的腫瘤標記物主要有以下幾種，但是各腫瘤標志物都存在不同的缺點：

(1)、膀胱腫瘤抗原(BTA)：BTA試劑分為BTA?stat和BTA?test兩種；首先，這兩種試劑都不能獨立用于確診膀胱癌；另外，BTA試劑價格昂貴，目前尚難以全面推廣使用；

(2)、Lewis?X抗原檢測：Lewis?X是一種ABO血型相關抗原，在正常尿路上皮中不存在該抗原；而5%～89%的移行細胞癌可檢出Lewis?X，但Lewis?X與腫瘤的分級無關；

(3)、核基質蛋白22(nuclear?matrix?protein22，NMP22)：NMP22是核有絲分裂器蛋白，診斷膀胱癌的敏感性為48%～90%，特異性為70%～92%，NMP22對高級，高期膀胱癌敏感性較高；

(4)、纖維蛋白/纖維蛋白降解產物(fibrin?degradation?products，FDP)：用快速免疫檢測法測定尿中FDP診斷膀胱癌的敏感性為68%，對T2～T4期膀胱癌的敏感性更是高達100%；

(5)、玻璃酸酶檢測hyaluronidase,HAase：玻璃酸酶是一種細胞外降解基質透明質酸的內源性糖苷酶，在腫瘤進展中起重要作用，應用凝膠技術檢測G2，G3級膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性達92%～100%；

(6)、端粒酶活性(telomerase)：端粒是位于染色體末端的保護性結構，隨細胞分裂逐步縮短，直至細胞死亡，端粒酶的作用就是延長端粒，現已發現多種腫瘤細胞中端粒酶活性增強，該法診斷包括低級，低期腫瘤在內的膀胱癌，敏感性可達91%。

然而，導致膀胱腫瘤發生的關鍵點仍未完全闡明，同時由于這些個體標記的靈敏性較低以至于未被應用于臨床實踐中，這表明需要新的靈敏性高的生物標記及相應的檢測技術。

發明內容

在PCR擴增時，引物的延伸是從其3'未端開始的，要求引物3'端的堿基與模板需嚴格配對，只有這樣引物才能延伸，擴增才得以進行下去從而切割TaqMan探針的阻遏基因，產生可供檢測的熒光信號。若引物3'端與模板不能配對，則引物的延伸被阻斷，不能檢測到相應的熒光信號，基于以上事實，利用3'端含突變堿基的引物進行TaqMan?Probe?Real?time?PCR擴增，可以檢測靶DNA中有無相應的突變位點。針對一個特定突變位點的反應系統包含兩個PCR擴增反應，分別設計兩對3'端存在差異的引物，一為正常引物，另一為3'端突變的引物，正常引物與正常模板嚴格配對，PCR時擴增相應的產物，而突變的引物只與突變的模板擴增出相應的產物。用兩對引物同時擴增突變和正常樣品，可以得到不同的擴增循環數比值△Ct，通過對兩對引物的擴增循環比值進行比較判定，可以確定被測樣品中是否存在突變位點。

在本發明的試驗過程中，在超過85%的人類腫瘤研究中發現端粒酶逆轉錄酶(TERT，TERT通過Human?Genome?Browser獲取NCBI發布版本37的人類基因組序列：Feb.2009(GRCh37/hg19)；>hg19_ensGene_ENST00000310581_0range=chr5:1295163-12965625'pad=4003'pad=0strand=-repeatMasking=none)活躍,我們認為是一個人類腫瘤發生的重要機制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5號染色體短臂,在人類腫瘤中調節端粒酶活性。最近人們應用全基因組測序在黑素瘤中發現TERT啟動子突變。人們在一些膀胱癌樣本中證實了高頻率的TERT啟動子突變。一些研究發現,具有活性的端粒酶或TERT表達增加與腫瘤的病理分期以及臨床分期是相關聯的。然而,人們還未獲得TERT基因拷貝，TERT的表達或活性對膀胱癌的臨床影響仍然是有爭議的。