[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)人紅細(xì)胞的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410042250.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103740642A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 婁彩玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 婁彩玲
• 主分類號(hào): C12N5/078
• 分類號(hào): C12N5/078;C12N5/0735
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開(kāi)磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體而言，涉及一種生產(chǎn)人紅細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

目前，人紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，紅細(xì)胞是血液運(yùn)送氧氣的最主要的媒介。當(dāng)人失血時(shí)，需要快速的補(bǔ)充紅細(xì)胞，而目前紅細(xì)胞來(lái)源主要是人體血液，而輸注的人血主要來(lái)源于志愿獻(xiàn)血者或是職業(yè)賣血者，不但血源奇缺，且價(jià)格昂貴，此外，血液中還可能攜帶病毒等，給需要輸送血液的人的生命造成額外的威脅。因此，目前的紅細(xì)胞來(lái)源非常單一，且產(chǎn)量極其有限，不能滿足需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)人紅細(xì)胞的方法，以解決上述的問(wèn)題。

在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種生產(chǎn)人紅細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

（a）將購(gòu)入的帶有CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)；

（b）將擴(kuò)增培養(yǎng)的帶有CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞接種至鋪有骨髓細(xì)胞系S17的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至細(xì)胞由扁平變圓；

（c）將得到的全部細(xì)胞進(jìn)行分選得到未脫核的人紅細(xì)胞；

（d）將未脫核的人紅細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)至成熟，得到脫核的人紅細(xì)胞。

優(yōu)選地，該方法中的培養(yǎng)基均為干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

所述干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基具體成分為：DMEM培養(yǎng)基中加入15%的2%人血白蛋白，1mM丙酮酸鈉，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸各為0.1mM,2mM谷氨酰胺，0.1mM巰基乙醇，1L?DMEM培養(yǎng)基加入1×10⁶U青霉素和1×10⁶U鏈霉素。

優(yōu)選地，該方法中所述的培養(yǎng)條件均為溫度37℃，5%CO₂，培養(yǎng)濕度為40%-70%。

優(yōu)選地，該方法中均以5%-10%的接種量進(jìn)行培養(yǎng)，接種的細(xì)胞濃度為4.0×10⁶個(gè)/ml～9.0×10⁶個(gè)/ml。

優(yōu)選地，在所述步驟（a）中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體為將帶有CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

優(yōu)選地，在所述步驟（a）中，培養(yǎng)時(shí)間為24-72h。

優(yōu)選地，在所述步驟（b）中，所述鋪有骨髓細(xì)胞系S17的培養(yǎng)皿為培養(yǎng)皿底面鋪上一層骨髓細(xì)胞系S17。

優(yōu)選地，在所述步驟（b）中，培養(yǎng)24-34h時(shí)細(xì)胞由扁平變圓。

優(yōu)選地，在所述步驟（c）中，所述分選采用流式細(xì)胞儀。

優(yōu)選地，還包括將脫核的人紅細(xì)胞進(jìn)行冷凍干燥后于-4℃保存。

本發(fā)明實(shí)施例提供的一種生產(chǎn)人紅細(xì)胞的方法，采用人干細(xì)胞在體外生產(chǎn)紅細(xì)胞，生產(chǎn)量可控，且可根據(jù)市場(chǎng)需求進(jìn)行定量的生產(chǎn)，以滿足需要。

附圖說(shuō)明

圖1為未篩選的培養(yǎng)得到的細(xì)胞圖；

圖2為流式細(xì)胞儀分選出的陽(yáng)性的未脫核的人紅細(xì)胞圖；

圖3為顯微鏡下觀察流式細(xì)胞儀分選出的未脫核的人紅細(xì)胞圖；

圖4為顯微鏡下觀察脫核的人紅細(xì)胞圖；

圖5為脫核的人紅細(xì)胞的細(xì)胞氧解離曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種生產(chǎn)人紅細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

將購(gòu)入的帶有CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)；

將擴(kuò)增培養(yǎng)的帶有CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞接種至鋪有骨髓細(xì)胞系S17的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至細(xì)胞由扁平變圓；

將得到的全部細(xì)胞進(jìn)行分選得到未脫核的人紅細(xì)胞；

將未脫核的人紅細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)至成熟，得到脫核的人紅細(xì)胞。

帶有CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞購(gòu)自德國(guó)的MILTENYI干細(xì)胞庫(kù)，貨號(hào)為130-046-702。帶有CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞是已經(jīng)建立的成熟且已經(jīng)商品化的細(xì)胞系。

不同生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)不同，本發(fā)明中CD34標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的條件均為溫度37℃，5%CO₂，培養(yǎng)濕度為40%-70%，這種生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)較好。

若細(xì)胞的接種密度過(guò)小，細(xì)胞的滯留期就會(huì)比較長(zhǎng)；而細(xì)胞接種密度比較大，則很快就能進(jìn)入對(duì)數(shù)期，不利于快速繁殖。因此，優(yōu)選地，該方法中均以5%-10%的接種量進(jìn)行培養(yǎng)，接種的細(xì)胞濃度為4.0×10⁶個(gè)/ml～9.0×10⁶個(gè)/ml。