[發明專利]一種能識別多種脊椎動物vigilin的單鏈抗體P33D1

有效

• 申請號: 201410041850.6
• 申請日: 2014-01-29
• 公開（公告）號: CN103820464A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 袁麗;鐘利橋;戴和平;饒瑜;李周全;張曉華
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C07K16/18
• 代理公司: 武漢荊楚聯合知識產權代理有限公司 42215
• 代理人: 王健

1.一種能識別多種脊椎動物vigilin的單鏈抗體P33D1的DNA序列為：

ATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTACGGGTAACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA。

2.根據權利要求1所述的一種能識別多種脊椎動物vigilin的單鏈抗體P33D1，其特征在于，該單鏈抗體P33D1的氨基酸序列為：

MAEVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCATGNYGYYYAMDYWGQGTSVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA。

3.實現權利要求1所述的一種能識別多種脊椎動物vigilin的單鏈抗體P33D1的制備方法，該方法包含下列步驟：

（1）選取斑馬魚vigilin碳末端的序列，將該序列克隆到pET28a載體中，在大腸桿菌BL21中表達重組vigilin蛋白，用His?bind樹脂純化，將純化后的vigilin重組蛋白固定在Ni-NTA?HisSorb?Plate上；

（2）將鼠源天然抗體噬菌體展示單鏈抗體文庫拯救后，用重組vigilin蛋白對噬菌體展示單鏈抗體文庫進行三輪淘選，得到單鏈抗體文庫的菌液；

（3）將菌液涂在氨芐抗性的平板上，30℃培養至長出單菌落；

（4）對各單菌落用ELISA方法鑒定可特異識別重組vigilin蛋白的單鏈抗體陽性克隆菌株，選取A_450nm值較高的單鏈抗體陽性克隆菌株，將該克隆株命名為P33D1菌株；

（5）對P33D1菌株的單鏈抗體進行DNA測序，如果該DNA序列與權利要求1所述的一種能識別多種脊椎動物vigilin的單鏈抗體P33D1的DNA序列相同，進行步驟(6)；如果該DNA序列與權利要求1所述的一種能識別多種脊椎動物vigilin的單鏈抗體P33D1的DNA序列不同，返回步驟(1)；

（6）將P33D1菌株誘導表達為可溶性單鏈抗體P33D1；

（7）用Western?Blot方法檢測單鏈抗體P33D1對成年雄性和雌性斑馬魚肝臟、小鼠肝臟以及人的子宮頸癌細胞vigilin的識別，結果顯示該單鏈抗體P33D1能夠特異識別斑馬魚，小鼠以及人的vigilin；

（8）該單鏈抗體即為一種能識別多種脊椎動物vigilin的單鏈抗體P33D1。