[發明專利]基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201410041348.5
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103757126A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 張忠英;唐晶
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/34;C12N15/11
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及microRNA，尤其是涉及一種基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞中的長約22個核苷酸的非編碼RNA分子，參與了在生物體中許多生理病理過程,通過調節基因表達,在細胞增殖、凋亡、生長發育、細胞分化、代謝等過程中發揮重要作用。具體表現為miRNA在細胞核內經過形成最初的初級轉錄本pri-miRNA到pre-miRNA，后轉運出細胞核，通過剪切形成成熟miRNA，通過與Ago蛋白等形成RISC（RNA誘導的沉默復合體），部分抑制或降解靶mRNA序列，參與基因表達調控（Bartel?DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and?function[J].Cell,2004,116(2):281-297）。

由于miRNA在腫瘤的發生、發展、預后判斷以及許多其他疾病狀態下扮演著重要角色，精確檢測其表達情況對于研究miRNA的作用具有重大意義，目前檢測miRNA的方法主要有northern?blot技術、實時熒光定量PCR技術、原位雜交技術、微陣列芯片技術等。其中northern?blot技術是RNA檢測的早期手段之一，但其特異性和敏感性低，如果樣本RNA含量低或存在降解，可能檢測不到；原位雜交技術用于檢測組織和細胞水平miRNA的分布情況，同時對miRNA進行半定量檢測，其不足之處在于不能準確檢測到低表達的miRNA；微陣列芯片技術是一種高通量的檢測技術，能同時檢測一種或多種樣本的大量的miRNA，但存在芯片制作費時、費力、標記成本高、檢測靈敏度與特異性低等問題。

實時熒光定量技術（RT-qPCR）是目前最普遍用于基因表達檢測的技術之一，具有簡便快速、敏感性高和特異性好等特點。目前用于檢測miRNA的實時熒光定量PCR方法包括RNA逆轉錄和下游的熒光定量PCR兩部分，其中逆轉錄根據反轉錄引物的不同分為兩種：同聚物加尾法和莖環逆轉錄法；熒光定量PCR的檢測分為染料法和探針法，其中目前檢測miRNA的探針多為Taqman-MGB探針（一種適合于擴增短片段的熒光探針）。由于成熟的miRNA具有片段短小的特點，要特異的檢測，探針法更有優勢，在敏感性和特異性上優于染料法。基于莖環結構的逆轉錄引物能特異識別，擴增成熟的miRNA序列，而miRNA的前體并未被擴增，Taqman-MGB探針檢測miRNA的缺點在于合成價格貴，不利于推廣。

目前AllGlo探針已經成功應用于檢測皰疹病毒、乙型肝炎病毒基因突變（Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid?detection?of?the?hepatitis?B?virus?YMDD?mutant?using?AllGlo^TM?probes[J].Clin?Chim?Acta,2011，412(11-12)：1018-1021）、侵襲性曲霉菌病（Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The?establishment?and?evaluation?of?diagnostic?accuracy?of?AllGlo(TM)probe-based?techniques?for?invasive?aspergillosis[J].Zhong?hua?Nei?Ke?Za?Zhi,2010,49(2):142-145）、K-ras基因突變、強直性脊柱炎等檢測。

發明內容

針對現有檢測miRNA方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的上述缺陷，本發明的第一個目的在于提供檢測miRNA的特異引物。

本發明的第二個目在于提供基于AllGlo探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒。

本發明的第三個目的在于提供一種基于AllGlo探針熒光定量PCR的miRNA檢測方法。

所述檢測miRNA的特異引物包括特異的逆轉錄引物和特異的正向引物；

所述特異的逆轉錄引物是指在核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1?5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC5＇-末端加上與miRNA序列3＇端8個反向互補的堿基；

所述特異的正向引物是指在miRNA的堿基序列去掉3＇端8個堿基，同時在5＇端加上6個堿基序列，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2?5＇-TCCCTC-3＇。