[發明專利]基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201410041348.5
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103757126A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 張忠英;唐晶
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/34;C12N15/11
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.檢測miRNA的特異引物，其特征在于包括特異的逆轉錄引物和特異的正向引物；

所述特異的逆轉錄引物是指在核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1?5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC5＇-末端加上與miRNA序列3＇端8個反向互補的堿基；

所述特異的正向引物是指在miRNA的堿基序列去掉3＇端8個堿基，同時在5＇端加上6個堿基序列，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2?5＇-TCCCTC-3＇。

2.基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于設有盒體、隔板、miRNA提取試劑瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設在盒體內，miRNA提取試劑瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，miRNA提取試劑瓶內裝有miRNA提取試劑，莖環逆轉錄試劑瓶內裝有莖環逆轉錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶內裝有實時熒光定量PCR試劑。

3.如權利要求2所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述miRNA提取試劑包括外源性參照cel-miR-39，其工作濃度為5n?mol；所述cel-miR-39的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3?5＇-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3＇。

4.如權利要求2所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述莖環逆轉錄試劑包括以下組份：200單位/μL的MMLV酶、10m?moldNTP混合液、5×RT緩沖液、40單位/μL的RNA酶抑制劑、10m?mol的MgCl₂、1μmol的特異的miRNA的逆轉錄引物、miRNA標準品，濃度為100n?mol；

所述特異的miRNA的逆轉錄引物是指在核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1?5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-5＇末端加上與miRNA序列3＇端8個反向互補的堿基；所述5×RT緩沖液由250m?mol?Tris-HCl，375m?mol?KCl，15m?mol?MgCl₂，50m?mol?DTT組成。

5.如權利要求2所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份：10×Taq緩沖液、10m?mol的MgCl₂、5單位/μL的Taq聚合酶、10mM?dNTP混合液、100ml無核酶水、10μmol特異正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探針；所述特異正向引物為在miRNA的堿基序列去掉3＇端8個堿基，同時在5＇端加上6個堿基序列，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2?5＇-TCCCTC-3＇；所述通用反向引物為SEQ?ID?NO.4?5＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇；所述AllGlo探針，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.5MAR-CACTGGATACGACGCTGCCG-MAR；所述10×Taq緩沖液包括100m?mol?Tris-HCl，500m?mol?KCl。

6.基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1）采用常規方法提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，則在200μL樣本充分裂解后加入基于AllGlo探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的濃度為5n?mol的外源性參照cel-miR-39?5μL，立即漩渦震蕩15s；若為細胞或組織樣本，則無需加入外源性參照cel-miR-39；

2）應用基于AllGlo探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的莖環逆轉錄試劑將miRNA逆轉錄為cDNA;

3）應用基于AllGlo探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增；

4）綜合分析儀器給出的各項數據，設定合理的閾值和基線，進行結果分析。

7.如權利要求6所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測方法，其特征在于所述AllGlo探針采用美國A1leLogic?Biosciences?Corporation公司的熒光定量探針。