[發(fā)明專利]一種檢測(cè)豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410040870.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-27
• 公開（公告）號(hào): CN103760365A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建;曹娟;廖園園;秦偉;朱薇;劉潔;漆世華;謝紅玲;馮釗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和動(dòng)物傳染病診斷研究領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)豬瘟病毒（CSFV）Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒。

背景技術(shù)

豬瘟是由豬瘟病毒（Classical?swine?fever?virus，CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，是世界糧農(nóng)組織和各國政府嚴(yán)密監(jiān)控和檢疫的主要傳染病之一。

CSFV屬黃病毒科瘟病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約12.3kb，僅含有一個(gè)大的開放性閱讀框架（ORF）。此ORF翻譯成含3898個(gè)氨基酸殘基，分子量約438kDa的多聚蛋白，并進(jìn)一步在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下加工成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒RNA上的編碼順序?yàn)镹pro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除C、Erns、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白外.其余均為非結(jié)構(gòu)蛋白。

豬感染CSFV后主要產(chǎn)生針對(duì)結(jié)構(gòu)糖蛋白E0、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的抗體。糖蛋白E0和E2是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的兩個(gè)主要保護(hù)性抗原，同時(shí)也是病毒吸附進(jìn)入敏感細(xì)胞的必需蛋白。

Erns，是病毒的一種囊膜糖蛋白，也稱gp44/48，舊稱E0。有9個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu268-Ala494組成。在感染細(xì)胞中Erns在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，并可存在于細(xì)胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚體形式存在于囊膜表面。由于其分子內(nèi)缺乏疏水的膜錨定區(qū)，與病毒囊膜結(jié)合力弱，易從囊膜上游離下來。Erns可誘導(dǎo)產(chǎn)生豬瘟的中和抗體，免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)致死量CSFV的保護(hù)性免疫。由于編碼Erns的核酸序列在屬內(nèi)比編碼E2的序列保守程度高，因此Erns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白。

E2為CSFV的另一囊膜糖蛋白，又稱為gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三個(gè)病毒糖蛋白中保守性最低、最易變異的分子。E2常以100kDa的同源二聚體及與E1形成75kDa的異源二聚體形式存在于病毒粒子及CSFV感染的細(xì)胞表面。E2可誘導(dǎo)產(chǎn)生CSFV的中和抗體，免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)致死量CSFV的保護(hù)性免疫。E2的蛋白骨架由370個(gè)氨基酸（ORF編碼的657-1062氨基酸殘基）組成，并以其C端的40個(gè)疏水氨基酸錨定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可為51-58kDa。E2的抗原決定區(qū)在其N端部分（ORF編碼的第690-866氨基酸），可分為2個(gè)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)單元，四個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域A、B、C、D。

豬瘟病毒的快速檢測(cè)對(duì)于豬瘟的診斷具有特別重要的意義。目前豬瘟病毒檢測(cè)方法主要有應(yīng)用病毒分離鑒定、免疫組織化學(xué)法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和Elisa檢測(cè)等。其中Elisa檢測(cè)法以其快速、方便、敏感等優(yōu)點(diǎn)，在眾多方法中脫穎而出。但市場(chǎng)中的Elisa試劑盒只有檢測(cè)單一抗原的試劑盒，在樣品保存不理想時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒。該試劑盒通過對(duì)豬瘟病毒Erns及E2蛋白進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，大大提高了豬瘟病毒檢測(cè)的靈敏度、特異性和可重復(fù)性；同時(shí)，由于采用生物素-親和素檢測(cè)系統(tǒng)（BAS），進(jìn)一步提高了試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性，避免了假陰性出現(xiàn)的可能。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的使用方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種檢測(cè)豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，包含有：包被抗豬瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）單克隆抗體及抗豬瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）單克隆抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、CSFV陽性對(duì)照和CSFV陰性對(duì)照、洗滌液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗體混合液、酶標(biāo)鏈霉親和素、酶顯色底物和終止液。

所述的酶標(biāo)板包被的兩種單克隆抗體的量優(yōu)選均為0.1～0.5μg。

所述的多克隆抗體混合液中兩種抗體的濃度均優(yōu)選為10μg/mL。

所述的單克隆抗體和多克隆抗體是采用原核表達(dá)的CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原分別免疫Balb/c小鼠和家兔得到。其中，CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原的制備包含如下步驟：

（1）以豬瘟病毒的RNA為模板使用如下引物分別PCR擴(kuò)增CSFV-Erns和CSFV-E2片段，