[發明專利]一種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201410040870.1
• 申請日: 2014-01-27
• 公開（公告）號: CN103760365A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 李建;曹娟;廖園園;秦偉;朱薇;劉潔;漆世華;謝紅玲;馮釗
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于包含有：包被抗CSFV-Erns單克隆抗體及抗CSFV-E2單克隆抗體的酶標板、樣品稀釋液、CSFV陽性對照和CSFV陰性對照、洗滌液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗體混合液、酶標鏈霉親和素、酶顯色底物和終止液。

2.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：所述的酶標板包被的兩種單克隆抗體的量均為0.01～0.05μg；所述的多克隆抗體混合液中兩種抗體的濃度均為10μg/mL。

3.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：所述的單克隆抗體和多克隆抗體是采用原核表達的CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原分別免疫Balb/c小鼠和家兔得到。

4.根據權利要求3所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原的制備包含如下步驟：

（1）以豬瘟病毒的RNA為模板使用如下引物分別PCR擴增CSFV-Erns和CSFV-E2片段，

Erns(F)：5’-CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3’，

Erns(R)：5’-CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’；

E2(F)：5’-CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG-3’，

E2(R)：5’-CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG-3’；

（2）通過限制性內切酶及DNA連接酶將CSFV-Erns和CSFV-E2片段分別連接到pET30a載體上構建重組質粒pET30a-Erns和pET30a-E2-N；

（3）將重組質粒pET30a-Erns和pET30a-E2-N分別轉化到含有PGrO7重組質粒表達伴侶蛋白GroEL的BL21中進行原核表達得到CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原。

5.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：所述的酶標鏈霉親和素的濃度為10μg/mL；所述的抗CSFV-Erns單克隆抗體與兔抗CSFV-Erns多克隆抗體所針對的抗原表位不同；抗CSFV-E2單克隆抗體與兔抗CSFV-E2多克隆抗體所針對的抗原表位不同。

6.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：所述的樣品稀釋液為含1%?BSA、0.1%深海魚明膠、0.02%疊氮化鈉的0.01mol/L，pH?7.2～7.4的PBS。

7.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：所述的CSFV陽性對照為用樣品稀釋液100倍稀釋的豬瘟病毒感染過的豬血清；所述的CSFV陰性對照為用樣品稀釋液100倍稀釋的未感染過的豬瘟病毒的豬血清。

8.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：所述的洗滌液為含0.5%?Tween20的0.1mol/L，pH?7.2～7.4的PBS，使用前用去離子水稀釋10倍。

9.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于：所述的酶顯色底物為TMB顯色液；所述的終止液為1mol/L的H₂SO₄溶液。

10.權利要求1-9任一項所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）將待測樣品用樣品稀釋液按1:1稀釋，每孔100μL加入酶標板中，同時陽性對照及陰性對照各加2孔設置對照；

（2）加樣完成后，混勻孔中樣品，37℃孵育1小時；

（3）棄去孔中溶液，洗滌液清洗3～5次，最后拍干；

（4）每孔加入生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體混合液100μL，37℃孵育30min；

（5）重復步驟（3），每孔加入酶標鏈霉親和素100μL，37℃孵育30min；

（6）重復步驟（3），每孔加入酶顯色底物100μL，室溫避光反應10-15分鐘；

（7）每孔加入100μL?終止液，將酶標板置于酶標儀測定450nm吸光度值；

所述試劑盒判定標準為：檢測中CSFV陽性對照的OD值與CSFV陰性對照的OD值之差必須大于0.4時，檢測被認為有效；Cut?off=陰性對照光吸收值OD_450nm×2.1倍，樣品值=樣品光吸收值OD_450nm/CO值，其中，樣品值＞1為陽性；樣品值≤1為陰性。