[發明專利]一種shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體、重組質粒及其構建方法

在審

• 申請號: 201410040531.3
• 申請日: 2014-01-27
• 公開（公告）號: CN104805120A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 茍德明;康康;何潔凝;李潔璇;田生禮
• 申請（專利權）人: 茍德明;康康
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 廣州番禺容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

技術領域

本發明屬于功能基因組學研究領域，涉及一種慢病毒RNAi載體、重組質粒及其構建方法。

背景技術

RNA干擾（RNA?interference,RNAi）是一種在進化過程中高度保守的，由雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)誘發同源mRNA高效特異性降解的基因轉錄后沉默現象(Fire?A.,Nature,1998.391(6669):p.806-11.)。RNAi技術不僅揭示了細胞內基因沉默機制，是繼酵母雜交系、DNA芯片、基因敲除、反義RNA等技術后的又一解讀基因功能的有效研究手段，極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程。RNA干擾在細胞中的作用機制分為三個階段:第一個是起始階段，外源性或內源性雙鏈RNA分子被細胞內的Dicer酶加工剪切成21-25個核苷酸長度的小分子雙鏈(small-interfering?RNAs，siRNA)；第二個是RISC的組裝階段，產生的siRNA中其中一條鏈與Argonaute（Ago）及其相關蛋白組裝形成具有活性的沉默復合體RISC（RNA-induced?silencing?complex）；第三個是效應階段，組裝形成的具有活性的RISC作用于與其上的單鏈小分子RNA序列互補的mRNA，通過將該mRNA降解使其翻譯受到抑制，最終導致基因的沉默(Siomi,H.and?M.C.Siomi,Nature,2009.457(7228):p.396-404)。

但是，在RNAi的實際應用中經常發現，即使是合理設計的shRNA仍不能發揮有效的干擾作用。經過分析，歸納出了影響shRNA干擾效果的幾種因素：如驅動siRNA表達的啟動子、siRNA作用位點、多個siRNA的串聯表達、siRNA與RISC的結合情況和干擾載體的轉染效率等(Dykxhoorn,D.M.and?J.Lieberman,Annu?Rev?Biomed?Eng,2006.8:p.377-402)。

針對上述問題，研究人員致力于發現增強shRNA干擾效率的RNAi相關蛋白因子。Ago2是Argonaute蛋白家族中唯一包含有切割活性的蛋白質。細胞內RNAi離不開Ago2的參與(Juvvuna?P.K..Nucleic?Acids?Res,2012.40(14):p.6808-20)，Ago2不僅可與siRNA結合，還可通過與miRNA結合從而提高成熟miRNA在細胞中的水平和穩定性(Ghildiyal?M.and?P.D.Zamore.Nat?Rev?Genet,2009.10(2):p.94-108)。細胞內的siRNA和miRNA則競爭性地與數量有限Ago2結合，外源導入siRNA可能會導致如下情況：一方面，細胞內大多數Ago2可能被miRNA占據，外源導入的shRNA則可能由于沒有足夠的Ago2來對其進行裝載，從而導致部分shRNA未能發揮作用就被降解；另一方面，研究表明siRNA、shRNA比pre-miRNA在結合RISC方面存在優勢，說明進入細胞的外源shRNA可能比miRNA優先占用細胞內RISC即消耗Ago2(Castanotto?D.Nucleic?Acids?Res,2007.35(15):p.5154-64)，那么內源性miRNA可能由于沒有足夠的Ago2對其進行裝載而被降解，導致依賴miRNA途徑的細胞活動受到影響。因此，細胞內Ago2的可用數量不足，不僅會影響shRNA干擾作用的發揮，也可能影響細胞內miRNA正常功能的運作。在維持細胞miRNA正常功能的前提下，細胞內RNAi的效率很大程度上取決于可用Ago2的數量。已經有研究證明，過表達Ago2蛋白可以提高哺乳動物細胞內的RNAi效率。