[發明專利]一種shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體、重組質粒及其構建方法

在審

• 申請號: 201410040531.3
• 申請日: 2014-01-27
• 公開（公告）號: CN104805120A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 茍德明;康康;何潔凝;李潔璇;田生禮
• 申請（專利權）人: 茍德明;康康
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 廣州番禺容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

1.一種shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體，其特征在于，所述RNAi載體包含shRNA表達框和Ago2蛋白表達框；所述shRNA表達框包含啟動子hU6、H1或7SK，以及ccdB致死基因；所述Ago2蛋白表達框包含CMV啟動子、Ago2蛋白表達基因、內部核糖體進入位點DNA序列和ZsGreen1綠色熒光蛋白表達基因。

2.根據權利要求1所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體，其特征在于，所述的ccdB致死基因的兩端設有限制性酶切位點BamHI和MluI。

3.權利要求1-2任一項所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備用于構建載體的骨架pLVX-IRES-ZsGreen1-Puro：

以pLVX-IRES-ZsGreen1載體為模板，擴增得到IRES-ZsGreen1片段，用Cla1-Xba1雙酶切PCR產物，然后通過相應的位點克隆到pLVX-Puro載體，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-Puro載體骨架。

(2)插入增強因子Ago2基因表達框CMV-Ago2：

用MluI和EcoRI雙酶切pIRESneo-FLAG/HA-Ago2載體，得到CMV-Ago2片段，將CMV-Ago2片段與步驟(1)回收的pLVX-IRES-ZsGreen1-Puro載體骨架連接，轉入大腸桿菌感受態細胞，涂LB平板，培養過夜，進行菌落PCR及酶切鑒定，得到的載體pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro；

(3)插入shRNA表達啟動子

用BclI和MluI雙酶切步驟(2)得到的載體pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro，去磷酸后電泳回收；用BclI和MluI雙酶切擴增hU6、H1或7SK啟動子的PCR產物后，連接到pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro載體的相應位點上，轉入大腸桿菌感受態細胞中，涂LB平板，培養過夜，鑒定后得到的載體為：pLVX-hU6/H1/7SK-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro。

(4)插入ccdB序列得到shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體：

從pLenti6載體擴增含有大腸桿菌ccdB致死基因的片段，用BamHI和Mlu?I雙酶切后與經BamHI和Mlu?I雙酶切的pLVX-hU6/H1/7SK-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro載體連接，轉入大腸桿菌感受態細胞中，涂LB/amp+Chl雙抗平板，培養過夜，進行菌落PCR及酶切鑒定，得到shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體，載體骨架是pLVX-hU6/H1/7SK-ccdB-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro。

4.一種shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒，其特征在于，包含權利要求1-2任一項所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體。

5.根據權利要求4所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒，其特征在于，還包含目的基因shRNA，所述shRNA的莖部長度為19～22bp，所述shRNA的loop長度是4～9bp。

6.根據權利要求5所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒，其特征在于，所述shRNA的莖部長度為20bp。

7.根據權利要求5所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒，其特征在于，所述shRNA的loop長度是6～9bp。

8.根據權利要求5所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒，其特征在于，所述shRNA的sense/antisense結構是從5’端開始的sense-loop-antisense結構。

9.權利要求4或5所述的shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）針對目的基因設計shRNA編碼序列，化學合成兩條引物，將兩條引物退火形成帶限制性內切酶BamHI和MluI黏性末端的shRNA；

2）通過限制性內切酶BamHI和MluI消化shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體骨架，酶切回收后，將載體骨架與退火的shRNA進行連接,轉化大腸桿菌感受態細胞并涂板培養過夜；

3）將平板上長出的單克隆菌落進行DNA測序，確定shRNA編碼序列的正確插入，得到shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒。