[發明專利]鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達方法及其表達產物的應用

無效

• 申請號: 201410039809.5
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103773792A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 張梁;石貴陽;方煒;丁重陽;顧正華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/78;C12R1/465
• 代理公司: 無錫華源專利事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 馮智文

技術領域

本發明涉及AMP脫氨酶基因的原核表達，具體涉及一種鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶基因的原核表達方法及其表達產物的應用，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

AMP脫氨酶，英文名為AMP?deaminase，簡寫為AMPD，是一種氨基水解酶，其可催化AMP使其脫去氨基生成肌苷酸（IMP）和NH₃，IMP在食品以及制藥等領域中有重要應用。另外，AMP脫氨酶是嘌呤核苷酸代謝循環中的三種主要酶類之一，對于維持機體免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脫氨酶是工業生產中一種重要的酶。

AMP脫氨酶廣泛存在于各種生物體內。其最早由鼠骨骼肌制備，隨后又由人紅血細胞制備，目前工業化生產中通常由酵母、霉菌等微生物發酵產AMP脫氨酶，但是在酶的提取純化、酶活性以及穩定性等方面存在諸多問題。因此，利用DNA重組技術，將微生物來源的AMP脫氨酶基因在特定宿主中進行重組表達，可以有效改善上述問題。現在國內關于AMP脫氨酶基因重組表達的研究從未報道過，國外關于該酶的重組表達的研究較少，僅在申請號為CN200580013789.3的專利“放線菌來源的AMP脫氨酶及其應用”（申請人：天野酶株式會社）中報道過一次。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本申請人經過研究改進，提供一種鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達方法。本發明首次在大腸桿菌中成功表達了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶，實驗結果顯示該重組酶具有較高的酶活，且酶活性穩定。

本發明的技術方案如下：

鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達方法，是以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設計特異性引物擴增AMP脫氨酶基因序列，并在其兩端加入酶切位點，亞克隆至表達載體構建重組質粒，再將該重組質粒轉化大腸桿菌感受態，最后IPTG誘導表達，純化，得AMP脫氨酶表達終產物。

具體地，所述方法具體步驟如下：

（1）鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆

以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，以序列為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的引物對通過PCR特異性擴增AMP脫氨酶基因，并在其兩端分別加入EcoRI和Not?I酶切位點，純化回收PCR產物；

（2）重組表達載體的構建

將表達載體pET-28a和步驟（1）所得PCR產物均用EcoRI和Not?I雙酶切，連接所得酶切產物并轉化E.coli?JM109，用步驟（1）所述引物對進行菌落PCR篩選陽性克隆菌株；提取上述陽性克隆菌株質粒，轉化E.coli?BL21，篩選陽性克隆轉化子；

（3）AMP脫氨酶基因的誘導表達及表達產物的純化

挑取步驟（2）中陽性克隆轉化子單菌落接種至氨芐青霉素終濃度為100ug/mL的LB培養基中，于37℃、200r/min條件下振蕩培養過夜，再于相同條件下擴大培養至OD₆₀₀為0.8，加入IPTG至終濃度為1mM，然后于25℃、150r/min條件下誘導培養12h；離心收集細胞，加入PBS緩沖液后超聲破碎細胞，收集上清液，采用Ni-鰲合柱純化該上清液蛋白質，即得重組AMP脫氨酶表達終產物。

優選地，步驟（1）所述鼠灰鏈霉菌選自鼠灰鏈霉菌(Streptomyces?murinus）MCCC?No.1A01641。

具體地，步驟（1）所述PCR擴增條件為：95℃預變性5min，94℃變性30s，70℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環后72℃再延伸10min。

本發明還提供了上述原核表達方法制備得到的AMP脫氨酶表達產物在食品及醫藥等領域的應用。

本發明的有益技術效果在于：

本發明首次以鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因組為模板，通過重組載體pET28-AMPD的構建、轉化與陽克隆轉化子的篩選，IPTG誘導表達、重組酶的純化等步驟及其工藝參數條件的精心篩選和優化，在大腸桿菌中成功表達了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶；經檢測，本發明制備的重組AMP脫氨酶表達產物具有較高的酶活，酶活性穩定，其最適反應溫度為60℃，在30℃～60℃之間具有良好的熱穩定性，在pH6.0時酶活達到最大，在pH5.0～8.0之間酶活最穩定，易于純化，可應用于食品、醫藥等領域，為AMP脫氨酶的工業化生產奠定了基礎，

附圖說明

圖1為實施例2重組表達載體pET28-AMPD雙酶切驗證結果電泳圖。

圖2為實施例4重組AMP脫氨酶表達產物純化后SDS-PAGE蛋白電泳圖。