[發(fā)明專利]鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達(dá)方法及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410039809.5
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103773792A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張梁;石貴陽;方煒;丁重陽;顧正華
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/78;C12R1/465
• 代理公司: 無錫華源專利事務(wù)所(普通合伙) 32228
• 代理人: 馮智文

1.鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達(dá)方法，其特征在于：以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增AMP脫氨酶基因序列，并在其兩端加入酶切位點(diǎn)，亞克隆至表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，最后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化，得AMP脫氨酶表達(dá)終產(chǎn)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達(dá)方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆

以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，以序列為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的引物對通過PCR特異性擴(kuò)增AMP脫氨酶基因，并在其兩端分別加入EcoRI和Not?I酶切位點(diǎn)，純化回收PCR產(chǎn)物；

（2）重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將表達(dá)載體pET-28a和步驟（1）所得PCR產(chǎn)物均用EcoRI和Not?I雙酶切，連接所得酶切產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化E.coli?JM109，用步驟（1）所述引物對進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆菌株；提取上述陽性克隆菌株質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli?BL21，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子；

（3）AMP脫氨酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化

挑取步驟（2）中陽性克隆轉(zhuǎn)化子單菌落接種至氨芐青霉素終濃度為100ug/mL的LB培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜，再于相同條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.8，加入IPTG至終濃度為1mM，然后于25℃、150r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h；離心收集細(xì)胞，加入PBS緩沖液后超聲破碎細(xì)胞，收集上清液，采用Ni-鰲合柱純化該上清液蛋白質(zhì)，即得重組AMP脫氨酶表達(dá)終產(chǎn)物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達(dá)方法，其特征在于：步驟（1）所述鼠灰鏈霉菌選自鼠灰鏈霉菌(Streptomyces?murinus）MCCC?No.1A01641。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達(dá)方法，其特征在于步驟（1）所述PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，70℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)后72℃再延伸10min。

5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的原核表達(dá)方法制備得到的AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。