[發明專利]一種用于TAFI含量體外檢測的試劑盒及其體外檢測方法

有效

• 申請號: 201410038769.2
• 申請日: 2014-01-26
• 公開（公告）號: CN103760352A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 李文欣;劉峰
• 申請（專利權）人: 遼寧邁迪生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 劉陽

技術領域

本發明涉及一種檢測凝血酶激活的纖溶抑制物（thrombin-activatable?fibrinolysis?inhibitor，簡稱TAFI）含量的新方法，特別是TAFI含量的體外檢測方法。?

背景技術

眾所周知，血栓性疾病是一類嚴重影響健康的疾病，尤其是心腦血管栓塞性疾病已成為我國人口死亡的首位原因。由于血栓性疾病的臨床表現千差萬別，診斷和治療往往非常復雜，因此，早期發現、早期治療尤為重要。目前，血栓性疾病的檢查方法主要有心電圖、超聲心動圖、胸部X射線、血壓監測、頭顱X射線、腦CT掃描、腦MRI檢查、DSA、MRA、經顱多普勒超聲檢查等。射線類檢查會對人體產生一定程度的電離輻射，組織血流灌注的功能性成像檢查方法較多，這些檢查設備通常比較昂貴，增加了成本，有的還需特殊裝備，成像時間較長，無法短期獲得結果。在醫學檢驗中，尚缺乏一種簡單、快捷、準確的用于臨床預測心腦血管疾病等發生可能性的檢測方法，不利于對疾病的早期發現，早期治療。?

據相關文獻報導，TAFI具有被凝血酶激活后下調纖溶活性的功能，是一種存在于血漿中的含金屬Zn的羧肽酶前體，又被稱為血漿羧肽酶原B、血漿羧肽酶原U、血漿羧肽酶原R。TAFI前體由肝臟合成，是一條包含423個氨基酸的單鏈糖蛋白，在循環至血液中的過程中，切掉N端22個氨基酸的信號肽，形成401個氨基酸的56kDa的TAFI；TAFI也存在于血小板內，血小板激活時釋放至血液。凝血酶、胰蛋白酶、纖溶酶等蛋白水解酶可以作用于TAFI的Arg92，將其切割成20kDa的激活肽和具有羧肽酶活性的36kDa的TAFIa。TAFIa具有切除部分降解的纖維蛋白C端Arg或Lys的能力，使纖溶蛋白酶原不能被激活，因而具有下調纖溶系統的功能，但其構象具有高度不穩定性。?

TAFI于1988年被首次發現，活化后具有內在不穩定性，通常在?37℃條件下孵育2h失去活性，并且能特異性地分解底物上精氨酸。后經多位科技工作者對其cDNA進行分離以及測定，并利用纖溶酶原-瓊脂糖柱層析的方法從血漿中分離、提純其酶原蛋白pro-pCPB，進一步分析發現TAFI通過凝血酶激活后具有羧肽酶活性，發揮纖溶抑制作用。?

TAFI與心腦血管疾病有一定關系。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，簡稱AS）是缺血性心腦血管疾病（如心絞痛、心肌梗死、腦卒中等）共同的病理基礎，也是導致血管內血栓形成的主要原因。近幾年的研究表明，AS的發生發展與炎癥、凝血-纖溶調節系統密切相關。目前研究表明，TAFI通過降低纖溶活性可促進靜脈血栓的形成，血漿高TAFI水平能增加靜脈血栓事件。?

目前，用來檢測TAFI水平的方法主要有兩類，一類是通過測定酶活力的方法間接測定TAFI含量，即利用凝血酶和凝血酶調節蛋白激活TAFI，測定TAFIa的酶活力；另一類是免疫學方法，包括酶聯免疫吸附劑測定（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）和火箭免疫電泳。其中，夾心ELISA法檢測TAFI抗原是目前相對成熟的檢測方法，檢測靈敏度高，特異性強，準確性好，檢測方法安全易行。2005年出現了兩種針對TAFI的特異性單克隆抗體，成功運用ELISA方法檢測TAFI、TAFIa和失活的TAFI。但這些方法因自身存在一定的缺陷，都沒有成為國際公認的TAFI參照標準法。?

發明內容

本發明的目的是提供一種TAFI含量的體外檢測方法，它解決了現有技術存在的設備昂貴，檢測時間較長等缺陷，與其它檢測方法相比，具有操作簡便、快捷、成本低廉，診斷敏感，檢出限低等優點，作為用于臨床預測心腦血管疾病的輔助診斷，可顯著提高疾病的檢出率和準確率，有利于疾病的早期發現，早期治療；減少被檢者不必要的痛苦和醫療費用支出，提高被檢者的生存質量。?

其具體技術方案為：?

一種用于TAFI含量體外檢測的試劑盒，由TAFI快速檢測試紙、樣本稀釋液組成，其中TAFI快速檢測試紙由PVC板條、樣品墊、金墊、NC膜和吸水紙組成；樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液（PH7.0）。?

所述NC膜由T線和C線組成。?

酸鹽緩沖液配置方法為：取磷酸二氫鉀0.68g加0.1mol/L?NaOH溶液29.1ml,用水稀釋至100ml。?

所述試劑盒示蹤標志物為膠體金。?

TAFI快速檢測試紙的制備方法為：?

a.金墊的制備?