[發(fā)明專利]抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410035528.2
• 申請日: 2014-01-24
• 公開（公告）號: CN104805082A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張辰宇
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇命碼生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/85;C12N15/867;A61D19/04;A01K67/027
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的生物反應(yīng)器的制備方法以及利用該生物反應(yīng)器制備抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的方法，通過建立能夠特異性表達(dá)針對丙型肝炎病毒基因組的干擾核糖核酸(siRNA)的乳腺生物反應(yīng)器，為治療丙肝的siRNA藥物的研制和生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

背景技術(shù)

丙型肝炎病毒(Hepatitis?Cvirus)簡稱丙肝病毒(HCV)，于1978年被發(fā)現(xiàn)，其由外殼和其中的單鏈RNA組成。1989年，HCV基因組序列被首次獲得。HCV主要經(jīng)血源傳播，此外還可以通過其他方式傳播，如母嬰垂直傳播和性傳播等。HCV感染可引發(fā)丙型肝炎，但發(fā)病機理仍不十分清楚。臨床觀察資料表明，人感染HCV后所產(chǎn)生的保護(hù)性免疫力很差，臨床上50％的丙型肝炎病人可發(fā)展為慢性肝炎，甚至部分病人會發(fā)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌。

目前尚無針對丙型肝炎的疫苗，唯一的預(yù)防措施是防止血液接觸。被發(fā)現(xiàn)感染HCV后，通常采取的是聚乙二醇干擾素α-2a或α-2b(peginterferon)聯(lián)合病毒唑(ribavirin)治療。這也是迄今為止唯一有效的方案。但是，聚乙二醇干擾素與病毒唑單獨和/或聯(lián)合使用治療丙型肝炎帶來的毒副作用不容忽視，其在適宜人群和與其他藥物聯(lián)用方面也面臨諸多限制。

近年來出現(xiàn)了多種輔助抗病毒藥物治療的新型技術(shù)，包括核酶技術(shù)、細(xì)胞內(nèi)干擾性多肽或蛋白質(zhì)療法，以及DNA免疫療法等。其中，核酶(ribozyme)技術(shù)是指通過人工合成具有催化活性的小分子核酶，即有催化活性的單鏈RNA分子，例如發(fā)夾狀核酶，與靶RNA中的互補序列特異性結(jié)合進(jìn)而進(jìn)行切割。在上述新型技術(shù)中，小干擾核糖核酸(small?interfering?RNA，縮寫為siRNA)藥物又是一大熱點。RNA干擾(RNA?interference，縮寫為RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)人與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。此現(xiàn)象可對外來基因材料，如轉(zhuǎn)位子、病毒等對基因組的破壞起到防御作用。通過RNAi機制，siRNA可特異性地、有效地沉默靶基因。已有研究證明，siRNA作用于HCV、HBV和HIV，都能表現(xiàn)出抗病毒作用(Nat.Biotechnol.21(6)：639-644(2003)；S.B.Kapadia，et?a1.Interference?of?hepatitis?C?virus?RNA?repli?cation?by?short?interfering?RNAs.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(4)：2014-2018(2003)；J.A.Wilson.et?al.RNA?interference?blocks?gene?expression?and?RNA?synthesis?from?hepatitis?C?replicons?propagated?in?human?liver?cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(5)：2783-2788(2003)；A.P.McCaffrey，et?a1.Inhibition?of?hepatitis?B?virus?in?mice?by?RNA?interference.G.A.Coburn?and?B.R.Cullen.Potent?and?specific?inhibition?of?human?immunodeficiency?virus?type1replication?by?RNA?interference.J.Virol.76(18)：9225-9231(2002))。

雖然使用siRNA治療丙肝的療效前景樂觀，但仍需克服諸多方面的技術(shù)難題，包括siRNA的靶向性有效釋放、siRNA的制備等。目前，制備siRNA的方法主要有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、酶切長鏈dsRNA法、siRNA表達(dá)載體法和PCR表達(dá)框法。這些方法普遍存在產(chǎn)出率較低、生產(chǎn)成本較高的缺點。