[發明專利]四種果樹食心蟲分子鑒定引物及使用方法

有效

• 申請號: 201410033127.3
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103882116A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 陳茂華;李玉婷;鄭燕;王康;錢路;吳偉
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學;江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心;新源縣農業技術推廣站
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.四種果樹食心蟲分子鑒定引物，分子鑒定引物的序列為：

COI基因上游引物C1F：5’-TGGTCACCCAGAAGTTTA-3’

COI基因下游引物C1R：5’-AAGAGTAACATCAATAGAAG-3’

COII基因上游引物C2F：5’-ATTGCTTTACCATCTCTTCG-3’

COII基因下游引物C2R：5’-AAACTATGATTTGCTCCACA-3’。

2.根據權利要求1所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物，其使用方法，特征在于：包括如下步驟：

一、提取待鑒定樣品的基因組DNA；

二、以步驟一所得基因組DNA為模板，利用上述兩對引物對基因組DNA中的線粒體COI和COII基因進行PCR擴增；

三、取適量步驟二的PCR擴增產物用瓊脂糖電泳檢測結果，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，兩對引物擴增的片段大小分別為316bp和350bp，將得到的特異性產物測序，利用Chromas2.4軟件讀取測序結果，觀察峰圖并進行校對，通過軟件CLUSTALX1.83將所得序列進行多序列同源比對，并利用p-distance計算各食心蟲間的遺傳距離；結果表明與其中一種食心蟲中的序列相似度達到99％以上即可認為是該食心蟲，即通過序列差異來區分四種果樹食心蟲。

3.根據權利要求2所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物的使用方法，其特征在于：所述步驟二中PCR反應體系和條件為：PCR反應體系為25μL，含2×PCR?Master?mix12.5μL，正/反向引物各3μL，DNA模板2μL，含20～50ng?DNA，ddH₂O補足25μL；PCR反應條件為：94℃下預變性2min；而后35個循環，每個循環包括94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。

4.根據權利要求2所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物的使用方法，其特征在于：所述步驟三中使用1％瓊脂糖電泳檢測。

5.根據權利要求2所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物的使用方法，其特征在于：所述步驟一中，提取DNA的具體步驟如下：將樣本置于一無菌的1.5ml離心管中，充分研磨后加入180μl常用裂解液(含有100mmol?pH8.0Tris-HC1、25mmol?pH8.0EDTA、500mmol?NaC1，1％SDS)和20μl蛋白酶K，55℃孵育12-15小時至完全裂解；加入20μl?RNaseA，室溫孵育2分鐘；12000rpm離心5分鐘，轉移上清于一無菌離心管中；加入10μl10％SDS于裂解液中，立即漩渦5秒；加入700μl苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，立即漩渦5秒，12000rpm離心10分鐘；取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，12000rpm離心5min；取上清，加入等體積無水乙醇于裂解物，漩渦混合5秒；將全部的溶液加入吸附柱中，12000rpm離心30秒，棄去流出液；吸附柱中加入500μl75％乙醇，12000rpm離心30秒，棄去流出液，重復一次；12000rpm離心2分鐘，徹底去除殘留的乙醇；將吸附柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入200μl預熱60℃的TE溶液，室溫靜置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，洗脫DNA；重復洗脫DNA得到更多的DNA，洗脫出的DNA于-20℃保存。