[發明專利]一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株

在審

• 申請號: 201410032846.3
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN104805058A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 王樹偉
• 申請（專利權）人: 上海歐易生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/16;C12N15/85;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及基因制備與細胞培養技術領域，具體涉及一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株及其制備方法。

背景技術：

糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是一種由胰島素分泌不足和／或胰島素作用受損引起的以高血糖為特征的代謝性疾病，是目前繼心腦血管疾病、癌癥之后嚴重威脅人類健康的第三大疾病。糖尿病可分為胰島素依賴型(IDDM，即I型)，非胰島素依賴型(NIDDM，即II型)和妊娠糖尿病等幾種類型，其中II型患者占糖尿病病例的80％以上。目前全球II型糖尿病(2Diabetes?Mellitus，2DM)患者已經超過1.5億，預計到2025年II型糖尿病患者將達到3億。II型糖尿病不僅能引起微血管并發癥，如眼部病變、周圍神經病變、糖尿病腎病等；而且還能引起嚴重的大血管并發癥，如中風、心肌梗死、下肢血管阻塞性病變等。這些并發癥是導致患者致死、致殘的重要因素。因此治療糖尿病、控制糖尿病并發癥的發生和發展至關重要。

目前，II型糖尿病的治療是采用飲食控制、口服降糖藥物和注射外源性胰島素替代性治療。但上述方法均不能理想地控制血糖水平，而且還存在一定的副作用和限制，并最終導致糖尿病患者因出現胰島β細胞功能的嚴重衰退而致死或致殘。

GLP-1作為人體內功能性多肽，是迄今能誘導胰島素分泌的最強物質，其最顯著的作用是促進胰島β細胞功能再生，防止胰島β細胞凋亡，其增加胰島β細胞數量的作用尤為顯著，對II型糖尿病的治療顯示了非常好的前景。但是，GLP-1因易被人體內的二肽基肽IV(DPP-IV)降解；且其血漿半衰期不足2分鐘，必須持續靜脈滴注或持續皮下注射才能產生療效，這大大限制了GLP-1的臨床應用。

臍帶源間充質干細胞具有自我更新、多向分化等生物學特性，是目前公認的多種藥物運輸載體。因此，通過基因轉導技術將GLP-1基因導入臍帶源間充質干細胞內，并將臍帶源間充質干細胞輸注到人體內，使GLP-1蛋白在受損傷的胰島局部分泌并發揮治療作用。解決了GLP-1自身血漿半衰期短(不足2分鐘)，難以長時間持續發揮作用的問題。

因此，制備一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞，是目前進一步提高II型糖尿病療效亟待解決的問題。

發明內容：

本發明的目的是提供一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株，解決目前GLP-1蛋白在治療II型糖尿病時存在的GLP-1蛋白易被降解和其自身半衰期短等不足。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株，從人臍帶中分離克隆出人臍帶源間充質干細胞，采用pCDNA3.1真核表達質粒為載體，將外源性GLP-1基因轉入人臍帶源間充質干細胞，并經過G418加壓篩選培養獲得。

一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株的制備方法，包括如下步驟：

(1)人臍帶源間充質干細胞的分離和培養：取正常分娩的人臍帶組織，無菌收集、分離，將臍帶組織剪成1cm³的組織塊，加入含有終濃度為20ng／ml的FGFb的a-MEM培養液，于37℃，5％CO₂培養箱中培養，3天后，人臍帶源間充質干細胞從臍帶組織中爬出，待細胞達到80％融合率時，收集細胞，備用；

(2)pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體的構建：根據GeneBank上提供的GLP-1序列信息選取序列中的編碼基因部分，采用Overlap-PCR的方法獲得GLP-1基因全長，并通過T4DNA連接酶將GLP-1基因與pcDNA3.1mychis載體相連接，并轉化到DH5a大腸埃希菌中，通過克隆篩選與鑒定獲得pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體；

(3)將pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體轉導至人臍帶源間充質干細胞：采用Lipofectamine2000方法，將10μl?Lipofectamine2000與10μl?pCDNA3.1-GLP-1質粒DNA以及200μl無血清的DMEM／F12培養基混勻，于37℃，5％CO₂培養箱中培養20分鐘，再加入到人臍帶源間充質干細胞培養瓶內，培養4小時；再加入含有10％FCS的DMEM／F12培養基培養48小時，將pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體轉入到人臍帶源間充質干細胞內；