[發明專利]一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株

在審

• 申請號: 201410032846.3
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN104805058A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 王樹偉
• 申請（專利權）人: 上海歐易生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/16;C12N15/85;C12R1/91
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• 代理人: 暫無信息

1.一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株，其特征在于從人臍帶中分離克隆出人臍帶源間充質干細胞，采用pCDNA3.1真核表達質粒為載體，將外源性GLP-1基因轉入人臍帶源間充質干細胞，并經過G418加壓篩選培養獲得。

2.一種穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株的制備方法，包括如下步驟：

(1)人臍帶源間充質干細胞的分離和培養：取正常分娩的人臍帶組織，無菌收集、分離，將臍帶組織剪成1cm³的組織塊，加入含有終濃度為20ng／ml的FGFb的a-MEM培養液，于37℃，5％CO₂培養箱中培養，3天后，人臍帶源間充質干細胞從臍帶組織中爬出，待細胞達到80％融合率時，收集細胞，備用；

(2)pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體的構建：根據GeneBank上提供的GLP-1序列信息選取序列中的編碼基因部分，采用Overlap-PCR的方法獲得GLP-1基因全長，并通過T4DNA連接酶將GLP-1基因與pcDNA3.1mychis載體相連接，并轉化到DH5a大腸埃希菌中，通過克隆篩選與鑒定獲得pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體；

(3)將pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體轉導至人臍帶源間充質干細胞：采用Lipofectamine2000方法，將10μl?Lipofectamine2000與10μl?pCDNA3.1-GLP-1質粒DNA以及200μl無血清的DMEM／F12培養基混勻，于37℃，5％CO₂培養箱中培養20分鐘，再加入到人臍帶源間充質干細胞培養瓶內，培養4小時；再加入含有10％FCS的DMEM／F12培養基培養48小時，將pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體轉入到人臍帶源間充質干細胞內；

(4)篩選獲得穩定表達GLP-1蛋白的人臍帶源間充質干細胞株：向步驟(3)中所述的細胞培養瓶中加入含有G418的選擇培養基，經過72小時的篩選培養，篩選出存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體的人臍帶源間充質干細胞；通過亞克隆方法將存活的含pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體的人臍帶源間充質干細胞接種到96孔培養板內繼續培養，待含pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體的人臍帶源間充質干細胞形成克隆后擴大培養，并經蛋白印跡方法檢測證實后，確定獲得穩定表達GLP-1的人臍帶源間充質干細胞株。

2、根據權利要求2所述的穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株的制備方法，其特征在于：所述選擇培養基為含10％胎牛血清的DMEM／F12培養基。

3.根據權利要求2所述的穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株的制備方法，其特征在于：所述G418的濃度為200μg／ml。

4.根據權利要求2所述的穩定表達外源性GLP-1基因的人臍帶源間充質干細胞株的制備方法，其特征在于：所述含pCDNA3.1-GLP-1真核表達載體的人臍帶源間充質干細胞的培養采用貼壁培養的方法。