[發明專利]一種基于膜過濾技術的埃博霉素B分離提取方法

有效

• 申請號: 201410032266.4
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN103772407A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 龔國利;趙婷峰
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C07D493/04
• 分類號: C07D493/04
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

技術領域

本發明屬于抗生素分離提取領域，涉及一種基于膜過濾技術的埃博霉素B分離提取方法。

背景技術

埃博霉素B(epothilone?B)是一類大環內酯類化合物，分子式為C₂₇H₄₁NO₆S，相對分子量為506.25，熔點為93℃-94℃，具有多種生物活性，可以作為抗生素藥物，由德國國家生物技術中心(GBF)的G.等人于1993年首次報道。

不久以后，Merck實驗室在對7000種天然提取產物篩選紫杉醇類似物實驗中，再次發現了埃博霉素。并且發現它具有與紫杉醇相同的作用機制，可以促進GTP(三磷酸鳥苷)依賴性微管蛋白聚合形成微管，并且對微管有穩定作用。證明了埃博霉素對腫瘤細胞有抑制作用的這個事實。進一步研究發現，埃博霉素具有比紫杉醇優越的抗腫瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，結構簡單，有利于化學合成埃博霉素及結構衍生化。②埃搏霉素沒有紫杉醇細胞內毒素活性。③與紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表達型的多藥耐藥性細胞中也維持很大的細胞毒性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人類細胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性。所以，此抗癌藥物可能成為紫杉醇更新換代的新產品，對其開發研究具有重要的意義。

目前已有一些對埃博霉素B分離提取報道的相關文獻，如中國專利CN201310143836.2公開了一種發酵法制取埃博霉素B的方法，中國專利CN200610091035.6公開了埃博霉素B的制備方法和用途，等等。但都存在著一定的缺陷：其中用到的葡聚糖凝膠色譜（LH-20）等需要裝柱，平衡，上樣，洗脫等注意事項，步驟過于繁瑣，使得操作的效率較低而過程費用較高，分離一次需要較長的時間，產物的得率較低。

隨著生化分離技術的進步，各種先進的設備和工藝在生產中發揮越來越大的作用，特別是膜技術的發展和應用，使各種生化分離工藝大為改觀。膜過濾技術用于發酵產品的分離精制已有成功的先例。但是利用膜分離技術分離提取埃博霉素B的方法，經檢索還未見報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種基于膜過濾技術的埃博霉素B分離提取方法，該方法具有條件溫和，操作簡便，分離步驟少，選擇性好的特點，克服了現有技術存在的步驟繁瑣，收率不高等缺陷，并且使制得的埃博霉素B具有較高的純度。

為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：

（1）樹脂對發酵液進行吸附：將纖維堆囊菌在液體培養基中進行發酵，并向液體培養基中加入經過處理的大孔樹脂，發酵120-150h后過濾得到吸附樹脂，然后用蒸餾水清洗除去吸附樹脂表面粘附的菌體；其中，大孔樹脂的加入量為液體培養基體積的2-5%；

（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提步驟（1）中經過蒸餾水清洗的吸附樹脂，收集浸提液；

（3）用超濾膜過濾浸提液：將浸提液采用截留分子量為1000-5000的超濾膜過濾，去除大分子雜質得到粗提物；再將粗提物進行濃縮，得到濃縮液A；

（4）使用制備型HPLC檢測：將濃縮液A進行離心，收集上清液，再用HPLC檢測并合并埃博霉素B組分；

（5）結晶：將埃博霉素B組分進行真空濃縮，得到濃縮液B，將濃縮液B于-20～-10℃下進行低溫結晶，得到白色粉末狀結晶，即為埃博霉素B。

所述步驟（1）中纖維堆囊菌菌株號為ATCC25532或ATCC25569。

所述步驟（1）中大孔樹脂為XAD-16型大孔樹脂，并且采用如下方法進行處理：首先，用3～5倍大孔樹脂體積的甲醇浸泡大孔樹脂，搖床震蕩12h-16h后，除去甲醇，水洗至無甲醇味；再用甲醇浸泡12h-16h后，除去甲醇并水洗至無甲醇味。

所述步驟（1）中液體培養基成分為土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆餅粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值為7.2。

所述步驟（2）中乙酸乙酯的用量為大孔樹脂體積的3～5倍，浸提的時間為24-48h。

所述步驟（3）中超濾膜的材質為聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。