[發(fā)明專利]一種雞金銀羽位點基因型的分子鑒定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410032115.9
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN103789305A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龔炎長;王瑩;彭秀麗;李世軍;俸艷萍
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種分離的DNA序列，其序列為SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

2.權(quán)利要求1所述的一種雞金銀羽位點基因型的分子鑒定方法，其步驟是：

利用軟件primer?premier?5.0，根據(jù)雞SLC45A2基因的DNA序列設(shè)計引物對M4-S/A，引物長度為22bp，引物序列為：M4-S：5'??ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT??3'，M4-A：5'??AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT??3'；

以引物對M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μL體系如下：1.5μL?10×EasyTaq?Buffer(+Mg²⁺)，0.3μL?正反引物（10μM），0.15μL的dNTP（2.5mM），0.5U的Taq聚合酶，1μL的基因組DNA，加超純水補齊至15μL；反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，72℃再延伸5min，15℃，1min，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

電泳檢測PCR產(chǎn)物：取?6?μL?PCR產(chǎn)物，加3μL?6×Loading?Buffer，制備濃度為1.2?%的瓊脂糖凝膠，點樣后，在120V電壓下電泳40min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測，根據(jù)條帶的有無及大小判定是否擴(kuò)增成功；

限制性內(nèi)切酶酶切：酶切的反應(yīng)體系為：超純水3.6μL，10×bufferG?0.5μL，內(nèi)切酶4U，PCR產(chǎn)物1μL，于37℃酶切16h；

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物：采用濃度為40%、交聯(lián)度為19:1的聚丙烯酰胺，配制濃度為16%的聚丙烯酰胺凝膠，體系為：聚丙烯酰胺18?mL，5×TBE?9?mL，超純水18?mL，10%AP?350μL，TEMED?35μL，先300V電泳10min，再120V電泳5.5h；

銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果：銀染步驟如下：超純水漂洗兩遍，10%的無水乙醇漂洗10min；超純水漂洗兩遍，1%的硝酸漂洗10min；超純水漂洗兩遍，0.2%的硝酸銀加750μL甲醛避光漂洗20min；超純水漂洗兩遍，3%的氫氧化鈉加1mL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色；換超純水，拍照記錄分析結(jié)果；

在公雞中，條帶為64bp和16bp則為金羽純合子：Z^sZ^s；條帶為64bp、55bp和16bp則為銀羽雜合子：Z^SZ^s；條帶為55bp和16bp則為銀羽純合子：Z^SZ^S；

在母雞中，條帶為64bp和16bp則為金羽半合子：Z^sW；條帶為55bp和16bp則為銀羽半合子：Z^SW。