[發明專利]一種TAZ敲低或過表達的PC9細胞株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201410030314.6
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103849620A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 許偉;吳劍卿;程雁
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種TAZ因子敲低PC9細胞株的shRNA分子，其特征在于，所述shRNA分子的DNA片段的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

2.一種重組載體，其含有權利要求1所述的TAZ因子敲低PC9細胞株的shRNA分子。?

3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將權利要求1所述的DNA片段插入pGPU6/GFP/Neo載體的多克隆位點構建成的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA。?

4.一種TAZ因子過表達PC9細胞株的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將TAZ因子的基因片段插入到pEX-2載體的多克隆位點構建成重組表達載體pEX-2-TAZ-over。?

5.一種重組細胞，含有權利要求3或4所述的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或pEX-2-TAZ-over。?

6.根據權利要求5所述的重組細胞，其特征在于，所述重組細胞為人肺癌細胞PC9/TAZ-shRNA或人肺癌細胞PC9/TAZ-OVER。?

7.一種TAZ因子敲低PC9細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏編號為CCTCC?NO:C2013194，分類命名：人肺癌細胞PC9/TAZ-shRNA。?

8.一種TAZ因子過表達PC9細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏編號為CCTCC?NO:C2013178，分類命名：人肺癌細胞PC9/TAZ-OVER。?

9.一種TAZ因子敲低或過表達PC9細胞株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：?

a）將權利要求3所述的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或權利要求4所述的重組表達載體pEX-2-TAZ-over分別轉染PC9細胞得到重組細胞株；?

b）將步驟a）得到的重組細胞株分別經過G418篩選培養基培養，2～3天換一次液，篩選培養21天，獲得陽性細胞株；其中，所述的G418篩選培養基10%胎牛血清的DMEM中，加入G418使其終濃度為600μg/ml；?

c）將步驟（d）篩選得到的陽性細胞株，消化成單個細胞后計數，分別取1000個種入10cm的培養板上，G418繼續篩選2周后，可在顯微鏡下觀察到轉染含目的基因重組載體的細胞長成單克隆細胞團，低倍鏡下在培養板底部用記號筆標出單細胞克隆，將其轉入預先加入含600μg/ml?G418的DMEM完全培養基的24孔板?中，每個轉染體系挑取9個單克隆細胞團；?

d）步驟（c）篩選所得的單克隆細胞團，24孔板中細胞生長至80%～90%匯合率時，傳代至細胞培養瓶中培養，收集細胞，提取RNA和蛋白質，利用免疫細胞熒光、PCR和Western?blot方法檢測TAZ的表達陽性細胞株。?

10.權利要求2或3或4所述的重組載體在TAZ因子敲低或過表達肺癌細胞的應用。?