[發(fā)明專利]乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗制備及其試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410030180.8
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103784950A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設計）人: 沈麗;黃啟明;郝麗敏
• 申請（專利權）人: 北京弘潤源生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N5/0784
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技術領域

本發(fā)明涉及制備乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細胞和疫苗。特別地，本發(fā)明涉及采用鑒定的乳腺癌特異表達的人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域1蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽，負載樹突狀細胞的制備方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細胞疫苗。

背景技術

目前，乳腺癌是威脅女性健康最主要的疾病之一，中國是乳腺癌發(fā)病率增長速度最快的國家之一，約有47萬患者，現(xiàn)在乳腺癌發(fā)病率正以每年3％的速度遞增，已成為城市女性的第一殺手。現(xiàn)有技術即常規(guī)治療手段手術、化療和放療等可以去除或殺死機體大部分乳腺癌，但還存在一些殘余的乳腺癌細胞或產生耐藥的乳腺癌細胞成為癌癥復發(fā)和轉移的“元兇”，使得患者不能得到較長的生存期以及預后不佳。隨著分子生物學和細胞生物學的發(fā)展，臨床治療癌癥的技術也不斷呈現(xiàn)并發(fā)揮著很好效果，其中細胞免疫治療癌癥得到很好的發(fā)展，應用患者自體免疫細胞臨床治療乳腺癌取得良好的療效，能有效清除患者機體內殘余腫瘤細胞，抑制腫瘤的復發(fā)和轉移，而且臨床上無任何毒副作用。樹突狀細胞是機體內最大的抗原呈遞細胞，通過吞噬和加工機體內乳腺癌細胞，與T淋巴細胞結合并將抗原信息呈遞給T淋巴細胞，由該T淋巴細胞對腫瘤細胞產生細胞毒性作用。樹突狀細胞疫苗已在臨床上用于治療乳腺癌病人，樹突狀細胞如何獲得更佳地抗腫瘤效果，完全取決于腫瘤特異表達的抗原，因而篩選和找到腫瘤特異表達的抗原是樹突狀細胞發(fā)揮作用的關鍵環(huán)節(jié)。

人類表皮生長因子受體2(Human?Epidermal?Growth?Factor?Receptor2，Her2／neu)是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，由1255個氨基酸組成，720-987位屬于酪氨酸激酶區(qū)，屬于表皮生長因子受體家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，30％以上的人類腫瘤中存在HER2基因的擴增／過度表達(如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等)；其中20％-30％的原發(fā)性浸潤性乳腺癌有HER2基因的擴增／過度表達，提示HER2的過度表達與腫瘤的發(fā)生和侵襲有關，可提高轉移的危險；轉染的細胞和動物模型證實，其可改變腫瘤對激素和化療藥物的敏感性。

乳腺癌耐藥蛋白(Breast?cancer?resistance?protein，BCRP)含655個氨基酸殘基的跨膜蛋白，屬于ABC轉運蛋白超家族的成員，BCRP僅有6個跨膜區(qū)和1個ATP的結合位點，BCRP通過組成同二聚體或異二聚體構成跨膜通道而發(fā)揮功能，過表達BCRP的腫瘤細胞株對米托蒽醌，阿霉素，柔紅霉素，鬼臼乙叉甙和拓撲替康等產生交叉耐藥，是導致臨床乳腺癌治療失敗的最主要原因之一。人乳腺癌組織BCRP陽性表達率為35％以上，而且BCRP陽性表達率與耐藥和轉移正相關。

IQ基序與Sec7結構域1蛋白(IQ?motif?and?Sec7domain1，GEP100)與促使乳腺癌細胞轉移密切相關。其在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)了過高水平，激活Arf6導致非侵入性細胞在EGFR的刺激下變成侵入性細胞。相反地，當GEP100被抑止時，被注入高水平侵入性乳腺癌細胞的小鼠體內癌細胞轉移被抑止了。取自入侵性乳腺癌患者的臨床樣品中有高水平的GEP100，GEP100和EGFR的同時出現(xiàn)與腫瘤惡性化有關。

因而研究確認Her2／neu、BCRP和GEP100蛋白在乳腺癌患者表達顯著，其可作為乳腺癌耐藥及其復發(fā)轉移潛在的主要標志物。

綜上，針對特異表達Her2／neu、BCRP和GEP100蛋白的乳腺癌細胞進行殺傷具有很好的臨床應用意義，可以高效準確地對乳腺癌細胞進行清除，而且可以靶向惡性程度高的腫瘤細胞，并有效抑制乳腺癌的復發(fā)和轉移，同時不影響機體正常細胞。

發(fā)明內容

為了高效靶向乳腺癌進行殺傷和有效抑制乳腺癌的耐藥性、復發(fā)和轉移，本發(fā)明首先對乳腺癌特異表達并與腫瘤細胞的耐藥性、復發(fā)和轉移密切相關的腫瘤抗原進行篩選，發(fā)現(xiàn)Her2／neu、BCRP和GEP100蛋白在乳腺癌中特異表達，特別是在耐藥性的和復發(fā)轉移的乳腺癌細胞中高表達，而正常組織細胞中不表達。本發(fā)明通過抗原表位預測系統(tǒng)分析了Her2／neu、BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽，并進行細胞毒性T淋巴細胞實驗鑒定得到6條可引發(fā)細胞毒性T淋巴細胞反應的HLA-A201陽性的表位多肽。本發(fā)明是提供了Her2／neu、BCRP和GEP100蛋白的HLA-A201陽性的表位多肽，該多肽可以用于負載樹突狀細胞，引發(fā)特異性的靶向乳腺癌的細胞毒性T淋巴細胞反應。