[發(fā)明專利]一種人降鈣素原免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410029667.4
• 申請(qǐng)日: 2014-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN104792997B
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周澤奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津匯濱生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京商專永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11400
• 代理人: 方挺,孟潭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人降鈣素原的檢測(cè)方法，尤其涉及vde免疫檢測(cè)試劑盒，屬于生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)

降鈣素原(procalcitonin,PCT)是無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，分子質(zhì)量為13kD的糖蛋白，由116個(gè)氨基酸組成，包括N-殘端、降鈣素、下鈣素三個(gè)部分，其中1～57為N-殘端，60～92為降鈣素，96～116為下鈣素。1996年以來，PCT作為一種新型的診斷細(xì)菌感染以及其繼發(fā)的合并癥的鑒別診斷工具，在診斷敗血癥、敗血癥休克以及嚴(yán)重系統(tǒng)炎癥反應(yīng)等此類疾病診斷以及過程的追蹤觀察方面，PCT診斷具有明顯優(yōu)勢(shì)，且特異性高。2001年國際膿毒癥會(huì)議的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)已把PCT作為診斷指標(biāo)之一。近年來PCT被認(rèn)為是系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征、膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征等疾病的預(yù)警指標(biāo)，反映了全身性細(xì)菌感染的存在和嚴(yán)重程度。

在人體血液循環(huán)中，不僅存在全長(zhǎng)的PCT多肽(約13kD)，而且源自于PCT多肽的片段也廣泛存在其中，具體來說，相關(guān)文獻(xiàn)也討論過降鈣素部分上下游分別發(fā)生的蛋白水解切割(Muller等，Crit Care Med 2000；977-83；Whang等，J Clin Endocrinol Metab 1998；83:3296-301)。然而，關(guān)于此的實(shí)驗(yàn)證據(jù)很少，使用針對(duì)PCT的降鈣素部分的抗體通過親和層析從膿毒癥患者分離到循環(huán)中的PCT，并且已經(jīng)得出結(jié)論，即PCT3-116是主要的循環(huán)PCT物質(zhì)(Weglohner等，Peptides 2001；22:2099-103.)。目前可以確定的是，甲狀腺的C細(xì)胞首先合成前PCT，前降鈣素原主要由N端84個(gè)氨基酸(含由25個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽)、活性降鈣素(32肽)和Katacalcin(21肽)三部分組成，后兩部分被4肽(-Gys-Lys-Lys-Arg-)隔開。前降鈣素原進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)糖基化和酶切除導(dǎo)肽，轉(zhuǎn)變?yōu)镻CT，PCT又經(jīng)不同蛋白酶分別作用，先切除N端肽形成57肽，57肽進(jìn)一步降解即生成成熟降鈣素和Katacalcin，成熟降鈣素的C末端尚需酰胺化才能最后形成活性降鈣素，降鈣素為活性32肽。

實(shí)驗(yàn)證明，PCT濃度升高的主要原因是細(xì)菌內(nèi)毒素引發(fā)的全身效應(yīng)。PCT在檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)出的高度特異性的原因是：1、在正常個(gè)體中，PCT經(jīng)過一系列的體內(nèi)酶催化作用最后水解形成CT，故其血清中的PCT濃度很低，僅為10～50pg/ml。2、在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、敗血癥、急性/慢性肺炎、急性胰腺炎、活動(dòng)性肝炎和創(chuàng)傷等患者的血清中的PCT濃度會(huì)顯著升高，其濃度可達(dá)到正常水平的幾倍甚至上萬倍。研究表明，在LPS血類敗血癥相關(guān)因子作用下，靶細(xì)胞(PBMC)等應(yīng)急分泌PCT，這時(shí)PCT的分泌速率超過轉(zhuǎn)化速率(由PCT分解成CT)，或者該轉(zhuǎn)換過程缺少相關(guān)的水解酶，從而導(dǎo)致血清中PCT濃度成倍升高。3、在病毒感染、慢性非特異性炎癥等患者的血清中PCT濃度持平或稍有增加。因此，PCT可作為判斷病情與預(yù)后以及療效觀察的可靠指標(biāo)，它不僅與疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)，而且隨著病情的變化而變化。

目前國際上開展的PCT濃度檢測(cè)方法很多，主要有以下幾類：

(1)凝膠法，此方法費(fèi)事且不易形成自動(dòng)化檢測(cè)；

(2)酶聯(lián)免疫吸附法，傳統(tǒng)的ELISA法檢測(cè)操作復(fù)雜、反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、靈敏度低；

(3)放射免疫測(cè)定，此方法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性差，且存在放射性污染問題；

(4)免疫發(fā)光法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器；

(5)膠體金層析法，此方法靈敏度低，只能定性無法實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)；

在PCT的臨床檢測(cè)中，目前國際市場(chǎng)上免疫檢測(cè)產(chǎn)品包括法國梅里埃VIDAS，美國RB公司,美國RD公司等均有推出，VIDAS采用熒光法檢測(cè)，需要特定的儀器，才能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確定量；ELISA產(chǎn)品采用雙抗夾心法，先將PCT的特異抗體包被在酶標(biāo)板上，再加入待檢樣本37℃孵育，再加入辣根過氧化物酶(即HRP)標(biāo)記的單克隆抗體37℃孵育，待檢樣本中的抗原會(huì)與特異單克隆抗體結(jié)合并形成夾心結(jié)構(gòu)，再加入四甲基聯(lián)苯胺顯色，顏色的深淺和待檢抗原的濃度呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)PCT的檢測(cè)。此類產(chǎn)品在檢測(cè)時(shí)采用兩步法，檢測(cè)速度慢導(dǎo)致檢測(cè)耗時(shí)過長(zhǎng)，檢測(cè)的準(zhǔn)確度也存在不足之處；并且此類方法通常采用PCT單抗或多抗，檢測(cè)敏感性不足，在較低濃度下往往無法建立線性良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，導(dǎo)致其無法檢測(cè)較低濃度的PCT待測(cè)樣品。

發(fā)明內(nèi)容

在本發(fā)明的全文中，下述簡(jiǎn)寫分別代表的術(shù)語是：

PCT-人降鈣素原；

PBS-磷酸鹽緩沖溶液；