[發明專利]一種人降鈣素原免疫檢測試劑盒及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410029667.4
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN104792997B
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發明（設計）人: 周澤奇
• 申請（專利權）人: 天津匯濱生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙)11400
• 代理人: 方挺,孟潭

1.一種人降鈣素原免疫檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內包括PCT單克隆多抗包被的酶標板；至少兩個PCT標準品試劑瓶，每個PCT標準品試劑瓶中裝有不同濃度的PCT標準品；酶標試劑瓶，其中裝有酶標記的抗PCT的單克隆多抗；

所述抗PCT單克隆多抗為針對PCT抗原的N端、降鈣素或下鈣素中的多種肽段表位的多克隆抗體的混合物，用PCT抗原片段做為免疫原，經免疫動物、分離和純化抗血清得到；所述的PCT抗原片段為PCT抗原的N端、降鈣素、下鈣素；

所述PCT抗原片段通過下述步驟制備得到：

(1)取1份PCT全長抗原；

(2)配置2份酶解液：Prohormone Convertase、Carboxypeptidase、Aminopeptidase、Pepeitdyl Glycine Amidating Mono-oxygenase各30IU/g，溶解在2份20mM Tris，500mM NaCl，pH7.4或者PBS緩沖液中，pH7.4；

(3)加入酶解液，37℃水浴酶解2h～4h；

(4)將分別針對N端、降鈣素以及下鈣素抗原的三種單克隆抗體單獨偶聯到層析柱上，將酶解液依次過濾進行親和純化，從而獲得N端、降鈣素以及下鈣素三種抗原，具體步驟如下：

a將上述抗體分別結合到蛋白A或蛋白G微珠上，每份濕的微珠結合2份單克隆抗體，將抗體和蛋白A或蛋白G微珠混合制成勻漿，在總量為10份的溶液中加入1份微珠，室溫孵育1h，混勻；

b用10倍體積的0.2mol/L硼酸鈉，pH9.0洗滌微珠2次，每次以3000g離心2min或10,000g離心30s；

c用10倍體積的0.2mol/L硼酸鈉，pH9.0重懸微珠，留樣，加入足量的二甲基庚二酸酯固體至微珠勻漿中，使終濃度為20mmol/L；

d室溫孵育30min，并混勻，留樣；

e用0.2mol/L乙醇胺，pH8.0洗滌微珠1次以終止反應，然后重懸于0.2mol/L乙醇胺，室溫孵育2h，混勻；

f將抗體包被的微珠轉入層析柱中，用PBS緩沖液，pH7.4沖洗容器；

g用20倍柱床體積與制備抗原相同的緩沖液洗柱；

h將抗原液加到柱上，按每毫升柱體積1mL/h的速度使抗原溶液流過層析柱；

i用20倍柱床體積的結合緩沖液洗柱；

k采用分段洗脫法，連續以0.5倍柱床體積的洗脫緩沖液通過層析柱，分管收集每一組分份；

l檢測每管的抗原含量，將濃度高的各管合并。

2.根據權利要求1所述的人降鈣素原免疫檢測試劑盒，其特征在于：試劑盒內還包括洗液試劑瓶，其中裝有用于洗滌酶標版的洗液；樣本稀釋液試劑瓶，其中裝有稀釋樣本用的稀釋液；底液試劑瓶，其中裝有受酶催化顯色的底物溶液；終止液試劑瓶，其中裝有終止顯色反應的終止液；其中，所述樣本稀釋液、底物溶液和終止液分別如下：

樣本稀釋液：人工血清；

底物溶液：TMB溶液或PNPP溶液；

終止液：2mol/L硫酸溶液或3mol/L氫氧化鈉溶液。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述PCT標準品試劑瓶為5個，所述PCT標準品濃度范圍為0.05ng-100ng/mL，在此范圍內的任意五個不同濃度。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：酶標試劑瓶中為HRP標記或AP標記的抗PCT的單克隆多抗的酶標抗體。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒內還包括陽性質控試劑瓶和/或陰性質控試劑瓶。