[發明專利]一種高溫甘露聚糖酶ManAHr的制備方法及其基因和應用

有效

• 申請號: 201410029518.8
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103789282A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 詹志春;熊海容;王亞偉;周櫻
• 申請（專利權）人: 武漢新華揚生物股份有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所 42214
• 代理人: 周宗貴;劉榮

技術領域

本發明提供了一種高溫甘露聚糖酶ManAHr，以及其編碼基因序列重排與優化，包含該酶基因的重組表達載體，及其應用，屬于基因工程領域。

背景技術

甘露聚糖是半纖維素家族的重要成分之一，分為以下四個亞類：直鏈甘露聚糖，葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖。它們由甘露糖或甘露糖與葡萄糖組合以β-1,4-糖苷鍵形成骨架，另外半乳糖會以α-1,6-糖苷鍵連接于骨架上作為側鏈。甘露聚糖是軟木中半纖維素成分的主要組分，并廣泛分布于植物組織中，如角豆膠，魔芋和瓜爾豆膠等。

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）是水解β-1,4-D-吡喃甘露糖為主鏈的內切水解酶，作用底物主要是甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、以及半乳葡甘露聚糖。β-甘露聚糖酶主要屬于糖苷水解酶類第5和26家族，少部分屬于第113家族，其中第5家族又分為8個亞類，β-甘露聚糖酶屬于第7和8亞類，分別來源于真核生物和細菌，這兩個亞類成員之間的序列相似性低于20%（Larsson?AM,et?al.Three-dimensional?crystal?structure?and?enzymic?characterization?of?beta-mannanase?Man5A?from?blue?mussel?Mytilus?edulis.Journal?of?Molecular?biology2006,357:1500-1510.）。

隨著β-甘露聚糖酶的深入研究，其應用領域也在不斷的擴展，并擁有一個廣泛的工業酶應用市場，包括食品和飼料，咖啡萃取，生物乙醇生產，殺粘菌劑，制藥，紡織，洗滌，造紙，石油，天然氣工業，及生物技術等領域。在食品和醫療領域，作為甘露聚糖豐富來源的魔芋粉、角豆膠和瓜爾豆膠等被甘露聚糖酶降解為甘露寡糖后，能夠代替蔗糖作為食品添加劑，降低血糖，維持膽固醇平衡，增加腸道益生菌，并促進其生長和繁殖。動物的植物性飼料中添加甘露聚糖酶能破壞細胞壁釋放密封的能增高腸壁絨毛的營養物質，水解飼料中甘露聚糖等抗營養因子，降低飼料粘度，從而達到改善飼料吸收率的目的。在紙漿漂白的過程中需要除去木質素，使用甘露聚糖酶不僅能去除該雜質，同時又減少污染。軟木是紙漿的主要來源，含有15～20%主要成分為半乳甘露聚糖的半纖維素。這就使得具有該成分特異性的甘露聚糖酶成為軟木紙漿漂白的最佳選擇。樹膠中的甘露聚糖通常被用作冰激凌、調味醬、發膠、護發素等的增稠劑，而甘露聚糖傾向于吸附衣物纖維，因此很難去除含有甘露聚糖的污漬，采用含有耐堿甘露聚糖酶的洗滌劑則可以將其水解為易溶的小分子，使衣物等易漂洗。在石油和天然氣工業中，甘露聚糖酶作為鉆探過程中的優質生物破膠劑，具有成本低，破壞小，效率高等優點。甘露聚糖酶是天然多糖結構分析和植物細胞破壁的良好工具酶，生成具有增殖雙歧桿菌生理功效的低聚糖（Chauhan?PS,et?al.Mannanases:microbial?sources,production,properties?and?potential?biotechnological?applications.Applied?Microbiology?and?Biotechnology2012,93:1817-1830.）。

來源于細菌的甘露聚糖酶普遍比來源于真菌的甘露聚糖酶具有更高的耐熱性，將來源于細菌的甘露聚糖酶基因經序列優化后應用于可高密度培養的畢赤酵母，更適宜于工業化生產。本發明中，來源于嗜熱好氧細菌Caldibacillus?cellulovorans的甘露聚糖酶ManAd3由具有較優良的酶學性質（Sunna?A,et?al.A?gene?encoding?a?novel?multidomain?beta-1,4-mannanase?from?Caldibacillus?cellulovorans?and?action?of?the?recombinant?enzyme?on?kraft?pulp.Appl?Environ?Microbiol.2000,66(2):664-670.），屬于糖苷水解酶類第5家族，其基因大小為852bp，氨基酸序列大小為284aa，預測其分子量為31.3kDa，以角豆膠作為底物時該酶比活力為1949U/mg，最適溫度85℃，最適pH為6.0，在70℃下處理24h后仍能保持95%的相對酶活力。另外該酶對角豆膠的降解能力是對魔芋粉降解能力的6.7倍，將該酶基因序列優化后，在畢赤酵母表達系統中高效表達，并基于其優良性質，可在飼料添加劑、保健食品、造紙、洗滌、醫藥等領域具有廣闊的應用前景。

發明內容