[發明專利]重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法及應用

無效

• 申請號: 201410029495.0
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103740656A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 蘇彩霞;李邐;金貞姬;韓旭東;王琳;王文雯;徐德啟
• 申請（專利權）人: 大連漢信生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N7/02;A61K39/29;A61P31/14
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

技術領域

本發明屬于醫藥生物工程技術領域，具體涉及一種重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法及制備疫苗的應用。

背景技術

戊型肝炎(HepatitisE，HE)是一種急性地方性流行腸道疾病，主要由糞-口途徑傳播，戊型肝炎多為急性發病，一般不會發展為慢性肝炎。戊肝作為一種腸道傳染病在一些發展中國家可占到急性病毒性肝炎的50％。戊型肝炎臨床癥狀基本上與甲型肝炎相同，患者主要表現為黃疸、厭食、肝腫大、腹部疼痛、惡心，嘔吐以及發燒等癥狀，死亡率約為1%，高于甲肝。

戊型肝炎的第一次病原學鑒定是1983年Balayan等等通過一名志愿者的研究得到的，是Balayan等學者利用免疫電鏡技術在病人的急性期糞便和康復期血清中發現一個直徑27nm(27-34nm的范圍)的無包膜病毒顆粒。但是戊型肝炎病毒的細胞培養及組織培養均未成功，目前仍未找到實施的可獲得大量病毒的手段。隨著近年來人們對戊型肝炎病毒研究的不斷深入與完善，對于戊型肝炎病毒基因組表達也越來越明了，戊型肝炎病毒的基因工程疫苗成為生物科學領域研究的重點。在基因工程疫苗中，類病毒顆粒(Virus?Like?Particle，VLP)相比于可溶性抗原疫苗，因免疫原性與安全性更高，常作為疫苗的第一候選。

目前全世界范圍內研制成功上市的重組戊型肝炎疫苗采用的表達系統為原核大腸桿菌表達系統，表達的戊型肝炎病毒抗原通過體外合適的組裝條件才能形成戊型肝炎類病毒樣顆粒，原核表達系統的缺點在于表達的重組蛋白無法進行加工修飾，影響其生物活性。

發明內容

本發明針對上述現有技術的不足，提供一種重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒（HEV?VLPs）的純化及疫苗的制備方法，該漢遜酵母表達系統能夠直接表達、形成與天然戊型肝炎病毒顆粒大小一致的類病毒顆粒，通過一系列純化工藝獲得戊型肝炎類病毒顆粒，并制備成具有很好免疫原性的疫苗。

本發明的技術方案如下：

一種重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，包括以下步驟：

（1）將工作種子批重組戊型肝炎疫苗工程菌種進行培養發酵，收集發酵后的培養物；

（2）對步驟（1）中收集的發酵后的培養物先后進行細胞破碎、澄清和超濾、硅膠吸附、超濾濃縮換液、色譜純化和脫鹽，除菌過濾，制得純化的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒。

所述的工作種子批重組戊型肝炎疫苗工程菌種表達的目的蛋白為戊型肝炎病毒Ⅳ型結構區ORF2編碼蛋白第112-6O7氨基酸片段。

所述的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的大小為27-34nm。

步驟（1）中所述的培養發酵的具體方法為：將工作種子批重組戊型肝炎疫苗工程菌種按1%接種于200ml的酵母氮源培養基中，進行一級培養，當用紫外-可見分光光度法檢測一級培養物吸光度值A_600nm為10-20時，將培養物移種至2L的酵母氮源培養基中，當用紫外-可見分光光度法檢測二級培養物吸光度值A_600nm為10-18時，將培養物移種至甘油培養基中進行培養發酵、甲醇誘導表達，收集發酵后的培養物；

優選的，所述的一級培養的溫度為30-33℃，培養時間為20h；

優選的，所述的二級培養的溫度為30-33℃，培養時間為20h；

優選的，在甘油培養基中的培養溫度為30℃，培養時間為13-15h，培養體積為15-25L，然后以終濃度1%的速度流加甲醇進行誘導培養75-80h。

所述的細胞破碎的具體方法為：將收集的發酵后的培養物以4500轉/min的轉速進行離心20min，離心沉淀后的酵母細胞中加入PB緩沖液，使細胞濃度為50%，充分混勻后再以同樣條件離心取沉淀，離心沉淀中加入細胞破碎液，使細胞濃度為30%，再加入細胞破碎液體積的1%的Tween-80，0.1M/L的NaCl,用玻璃珠研磨法破碎，在破碎液中加入其體積4%的濃度為1%的PMSF溶液，1M/L的NaOH調節PH值為8.0，以7000轉/min的轉速離心40-50min去除沉淀得上清液；離心溫度優選2-8℃。

所述的澄清和超濾的具體方法為：將上清液通過0.65μm中空纖維柱進行澄清處理細胞碎片，用PB緩沖液沖洗9-10倍上清液體積，收集膜下透過溶液，將透過液通過0.2μm中空纖維柱進行超濾濃縮，用PB緩沖液沖洗5-6倍透過液體積，收集膜上液保存；所述的PB緩沖液PH值優選8.0。