[發明專利]重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法及應用

無效

• 申請號: 201410029495.0
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103740656A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 蘇彩霞;李邐;金貞姬;韓旭東;王琳;王文雯;徐德啟
• 申請（專利權）人: 大連漢信生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N7/02;A61K39/29;A61P31/14
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

1.一種重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將工作種子批重組戊型肝炎疫苗工程菌種進行培養發酵，收集發酵后的培養物；

（2）對步驟（1）中收集的發酵后的培養物先后進行細胞破碎、澄清和超濾、硅膠吸附、超濾濃縮換液、色譜純化和脫鹽，除菌過濾，制得純化的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒。

2.根據權利要求1所述的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，其特征在于，步驟（1）中所述的培養發酵的具體方法為：將工作種子批重組戊型肝炎疫苗工程菌種按1%接種于200ml的酵母氮源培養基中，進行一級培養，當用紫外-可見分光光度法檢測一級培養物吸光度值A_600nm為10-20時，將培養物移種至2L的酵母氮源培養基中，當用紫外-可見分光光度法檢測二級培養物吸光度值A_600nm為10-18時，將培養物移種至甘油培養基中進行培養發酵，甲醇誘導表達，收集發酵后的培養物；

優選的，所述的一級培養的溫度為30-33℃，培養時間為20h；

優選的，所述的二級培養的溫度為30-33℃，培養時間為20h；

優選的，在甘油培養基中的培養溫度為30℃，培養時間為13-15h，培養體積為15-25L，然后以終濃度1%的速度流加甲醇進行誘導培養75-80h。

3.根據權利要求1所述的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，其特征在于，所述的細胞破碎的具體方法為：將收集的發酵后的培養物以4500轉/min的轉速進行離心20min，離心沉淀后的酵母細胞中加入PB緩沖液，使細胞濃度為50%，充分混勻后再以同樣條件離心取沉淀，離心沉淀中加入細胞破碎液，使細胞濃度為30%，再加入細胞破碎液體積的1%的Tween-80，0.1M/L的NaCl,用玻璃珠研磨法破碎，在破碎液中加入其體積4%的濃度為1%的PMSF溶液，1M/L的NaOH調節PH值為8.0，以7000轉/min的轉速離心40-50min去除沉淀得上清液；離心溫度優選2-8℃。

4.根據權利要求1所述的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，其特征在于，所述的澄清和超濾的具體方法為：將上清液通過0.65μm中空纖維柱進行澄清處理細胞碎片，用PB緩沖液沖洗9-10倍上清液體積，收集膜下透過溶液，將透過液通過0.2μm中空纖維柱進行超濾濃縮，用PB緩沖液沖洗5-6倍透過液體積，收集膜上液保存；所述的PB緩沖液PH值優選8.0。

5.根據權利要求1所述的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，其特征在于，所述的硅膠吸附的具體方法為：于膜上液中加入硅膠溶液，攪拌吸附，再以4000轉/min的轉速離心20min去除上清液；在沉淀中加入原上清液體積44%的硅膠洗脫液，于57℃攪拌90min，然后以4000轉/min的轉速離心15min去除沉淀，上清液中加入氯化鈉混勻，靜置，以7000轉/min轉速離心10min，去除沉淀，收集上清液；

優選的，所述的硅膠溶液的濃度為7.5%，硅膠溶液的加入體積為上清液體積的40-50%；

優選的，所述攪拌吸附溫度為2-8℃，攪拌吸附時間為10-16h，所述的離心溫度為2-8℃；

優選的，所述的氯化鈉的體積為1/11硅膠洗脫液體積，氯化鈉的濃度為4M/L；

優選的，所述的靜置溫度為2-8℃，靜置時間為30min。

6.根據權利要求5所述的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，其特征在于，所述的硅膠洗脫液由包括以下質量體積濃度的組分組成：

四硼酸鈉???3.814g/L，

EDTA???????0.742g/L，

脫氧膽酸鈉?2.5g/L。

7.根據權利要求1所述的重組漢遜酵母戊型肝炎類病毒顆粒的純化方法，其特征在于，所述的超濾濃縮換液的具體方法為：將經硅膠吸附操作后得到的上清液過750K中空纖維柱，PB緩沖液清洗5-6倍上清液體積，膜上保留溶液濃縮至蛋白濃度2mg/ml-3mg/ml,收集保留濃縮溶液。