[發(fā)明專利]棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因HaTrf及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410028726.6
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103789320A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高希武;張雷;尚慶利;劉曉嵐;路瑤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/11;C07K14/79;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因HaTrf及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

化學(xué)殺蟲劑的廣泛使用對于有害生物的控制非常有用，但長時(shí)間以及大規(guī)模的使用化學(xué)殺蟲劑，對于環(huán)境以及高等食肉動(dòng)物的危害也是不可忽視的，化學(xué)殺蟲物質(zhì)的積累導(dǎo)致對這些物質(zhì)抗性的發(fā)展，并且可能在進(jìn)化梯中高等的物種中，成為誘變劑和/或致癌物，導(dǎo)致不可逆的和有害的遺傳修飾。植物次生物質(zhì)具有對病蟲草害防治效果好、且對人畜安全、不污染環(huán)境、無殘留對、病蟲草害特異性強(qiáng)、源于自然易被降解、害蟲和病菌難以產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。

植物次生性物質(zhì)是其在代謝過程中形成的產(chǎn)物，是植物自衛(wèi)的武器，植物通過次生物質(zhì)影響昆蟲的取食形成忌避效果或影響昆蟲的消化來保護(hù)自己，植物次生性物質(zhì)對昆蟲的寄主選擇、取食及生長發(fā)育具有重要的影響。昆蟲在進(jìn)化過程中也形成了特有的解毒排毒機(jī)制，弱化植物次生物質(zhì)的影響。昆蟲從寄主植物獲取營養(yǎng)成分后通過代謝作用從而完成生長發(fā)育全過程。植物通過自身所含營養(yǎng)成分的質(zhì)和量，以及種類繁多的次生代謝產(chǎn)物，來影響植食性昆蟲對寄主的趨性取食活動(dòng)，進(jìn)而影響昆蟲的生長發(fā)育和繁殖，造成昆蟲種群的波動(dòng)。植物次生物質(zhì)對昆蟲的影響及昆蟲對植物次生物質(zhì)的適應(yīng)，反映了植物與昆蟲的協(xié)同進(jìn)化。利用分子生物學(xué)技術(shù)對作物進(jìn)行改良，提高作物自身的抗蟲性或?qū)⒒瘜W(xué)防治與植物自身的抗性相結(jié)合的研究，將減少化學(xué)農(nóng)藥的用量。植物次生性物質(zhì)作為一種植物的防御性物質(zhì)能夠誘導(dǎo)昆蟲中防御性基因的表達(dá)，例如植物次生物質(zhì)能夠誘導(dǎo)昆蟲的解毒酶基因的表達(dá)。利用分子生物學(xué)手段干擾昆蟲潛在的防御基因，從而提高昆蟲對植物次生性物質(zhì)的敏感性，對制定新的抗藥性綜合治理策略具有深遠(yuǎn)的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因HaTrf，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

進(jìn)一步地，其全長編碼序列如SEQ?ID?No.1所示。

本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增前述轉(zhuǎn)鐵蛋白基因編碼序列的引物對，包括正向引物F：5’-GCCATGGTATCAAAAATAAAATATAT-3’和反向引物R：5’-AATAACATCATGGATTTGCTTGAA-3’。

本發(fā)明還提供了所述轉(zhuǎn)鐵蛋白基因HaTrf在抑制棉鈴蟲的生長發(fā)育中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用具體包括以下步驟：

1）以權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)鐵蛋白基因?yàn)槟０?，利用利用引物F1：CAAGCAGACATCGTGCCAGT和引物R1：GTCTAGCTGCCCAGGAACAG，擴(kuò)增得到棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因部分序列，所述部分序列如SEQ?ID?No.2所示；

2）根據(jù)步驟1）擴(kuò)增得到的棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因部分序列，用于通過體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成HaTrf基因的dsRNA，該dsRNA后與棉鈴蟲人工飼料混合飼喂2齡棉鈴蟲幼蟲。

優(yōu)選地，所述dsRNA的飼喂以雙蒸水為載體，dsRNA的飼喂量為35μg/g。

本發(fā)明還提供了所述轉(zhuǎn)鐵蛋白基因HaTrf在提高棉鈴蟲對植物次生物質(zhì)2-十三烷酮的敏感性中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用具體包括以下步驟：

1）以權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)鐵蛋白基因?yàn)槟０澹美靡颋1：CAAGCAGACATCGTGCCAGT和引物R1：GTCTAGCTGCCCAGGAACAG，擴(kuò)增得到棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因部分序列，所述部分序列如SEQ?ID?No.2所示；

2）根據(jù)步驟1）擴(kuò)增得到的棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因部分序列，設(shè)計(jì)HaTrf基因的dsRNA，通過體外轉(zhuǎn)錄試劑合成dsRNA后與植物次生物質(zhì)2-十三烷酮及棉鈴蟲人工飼料混合飼喂2齡棉鈴蟲幼蟲。

優(yōu)選地，所述dsRNA的飼喂以雙蒸水為載體，dsRNA的飼喂量為35μg/g。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供來自棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因HaTrf的基因全長以及用于合成dsRNA的序列，根據(jù)本發(fā)明的提供的基因全長及用于合成dsRNA的序列能夠用于干擾棉鈴蟲轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的表達(dá)，使棉鈴蟲出現(xiàn)生長抑制，并提高了昆蟲對植物次生性物質(zhì)的敏感性。

dsRNA干擾方法可提高作物抗蟲性從而應(yīng)用于對棉鈴蟲的防治，對于解決由于化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致的生態(tài)惡化以及殺蟲劑抗性等問題都有積極意義。

附圖說明

圖1為HaTrf全長電泳圖。