[發明專利]一種定向突變的半乳糖基轉移酶的應用

有效

• 申請號: 201410027426.6
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103849606A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 約瑟夫·弗戈邁爾;劉麗;陳歡
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;A23C9/12
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種定向突變的半乳糖基轉移酶1的應用。?

背景技術

隨著基因工程技術的迅速發展，我們已經可以通過基因改造手段培育各種生物新品系，尤其是針對一些模式生物的技術手段已經非常成熟。現在常用的基因改造手段有：轉基因技術、常規基因敲除技術、基因敲入技術和條件敲除技術等。比如基因敲入技術，可以特異性地在靶基因中引入突變點以模擬人類家族遺傳病的基因突變類型，也可以將外源基因整合到基因組的特定位點，或者進行物種間同源基因的替代。但是對具體突變位點以及突變方向的選擇，關系到突變型生物的具體功能，還需要進行大量研究。?

糖基轉移酶催化糖從供體的轉移過程，并負責糖苷鍵的形成。糖基轉移酶對核苷酸糖供體和接納體具有特異性。β1,4-半乳糖基轉移酶1是目前人們研究最為廣泛和深入的糖基轉移酶之一。該酶在哺乳動物的乳腺中表達量很高，且隨哺乳過程表達增高。在細胞中，半乳糖基轉移酶1主要分布在高爾基體上，其基本功能是負責將半乳糖基從糖供體UDP-半乳糖苷轉移至乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，形成β-1,4糖苷鍵。但已有的文獻表明，突變后的β1,4-半乳糖基轉移酶1將同時轉移半乳糖和乙酰氨基半乳糖，并且兩者的轉移效率相接近，都為50%^[1]。?

發明內容

本發明的目的是通過基因敲入技術，提供一種定向突變的半乳糖基轉移酶1。?

本發明的另一目的是提供該定向突變的半乳糖基轉移酶1的應用。?

本發明的目的可通過如下技術方案實現：?

定向突變的半乳糖基轉移酶1在生產不含乳糖或極低乳糖含量的天然奶中的應用，其中，所述的定向突變的半乳糖基轉移酶1是通過基因工程手段定向突變牛野生型β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者豬野生型β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列的第288位酪氨酸，或者其他哺乳動物相似位點的酪氨酸，使野生型的轉移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上變為突變型的轉移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上。?

所述的酪氨酸優選定向突變為亮氨酸。?

定向突變后的牛β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

定向突變后的豬β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

一種生產不含乳糖或極低乳糖含量的天然奶的方法，對哺乳動物β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列特定位點的酪氨酸進行突變，使野生型的轉移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上變為突變型的轉移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，從而使乳汁中的乳糖(Galβ1,4Glc)發生改變成為乳糖類似物(GalNAcβ1,4Glc)一種在牛初乳中本身微量存在的物質^[2]。?

本發明所述的極低乳糖含量是指基本不含有乳糖。?

所述的哺乳動物選自豬、牛或羊。?

所述的方法優選將牛野生型β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者豬野生型β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列的第288位酪氨酸定向突變為亮氨酸。?

定向突變后的牛β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

定向突變后的牛β1,4-半乳糖基轉移酶1氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

有益效果：?

本發明經過研究發現定向突變的半乳糖基轉移酶1能夠從野生型的轉移半乳糖變為基本只轉移乙酰氨基半乳糖，并非如現有技術中報道的突變后的β1,4-半乳糖基轉移酶1將同時轉移半乳糖和乙酰氨基半乳糖且兩者的轉移效率相接近都為50%，我們的實驗結果與現有報道有很大的區別。?

因為乳汁中乳糖的來源是由β1,4-半乳糖基轉移酶1轉移一個半乳糖基到葡萄糖基，從而生成乳糖。當我們突變了β1,4-半乳糖基轉移酶1后，β1,4-半乳糖基轉移酶1就轉移一個乙酰氨基半乳糖到葡萄糖基上，生成一種乳糖的類似物（GalNAcβ1,4Glc），而不再轉移半乳糖，所以乳汁中的乳糖則基本不再生成。?