[發明專利]一種簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達方法

在審

• 申請號: 201410027151.6
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103993004A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 李孝軍;王素華;張明哲;杜愛芳;陳璐敏;周圓;洪青林;唐行忠
• 申請（專利權）人: 舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;C07K14/44
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種簡單異尖線蟲Ani?s?4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于包括如下步驟：

①簡單異尖線蟲總RNA的提取，

②簡單異尖線蟲Ani?s?4抗原基因的RT-PCR擴增，

根據Ani?s?4抗原基因其閱讀框的序列特點，在序列的兩端分別加上BamHI和Hind?Ш酶切位點設計引物，同時增加保護性堿基；設計的引物如下：

上游引物5'—CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3'?（SEQ?ID?NO.1），

下游引物5'—CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA—?3'?（SEQ?ID?NO.2），

以步驟①提取的總RNA為模板，反轉錄出單鏈cDNA，經PCR擴增，獲得目的基因Ani?s?4，

③將純化后的目的基因PCR產物和pMD18-T載體進行連接，獲得重組質粒pMD18-T-Ani-s4；

④原核表達載體的構建和鑒定：

BamHI和Hind?Ш雙酶切質粒pMD18-T-Ani-s4和質粒pET-32a，回收所需目的片段，加入T4?DNA連接酶進行連接；將連接產物轉化感受態細胞，抽提質粒；再應用質粒轉化大腸桿菌，?BamH?I和Hind?Ш雙酶切篩選陽性克隆，命名為pET32a-Ani-s4；

⑤IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白，

含重組表達質粒的菌種活化后，將陽性菌接種到含Amp的LB液體培養基中，37?℃振蕩培養至菌液的OD值為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1?mmol/L后34?℃繼續振蕩培養進行誘導表達；?

誘導表達后通過SDS-PAGE分析，發現有特異性條帶出現，即完成簡單異尖線蟲Ani?s?4抗原基因的克隆和表達。

2.根據權利要求1所述的簡單異尖線蟲Ani?s?4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白的具體步驟如下：??

含重組表達質粒的菌種活化后，取1ml陽性菌接種到50mL含Amp的LB液體培養基中，于37?℃搖床中以195rpm振搖培養，至菌液的OD值約為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1?mmol/L后34?℃繼續振蕩培養，分別在誘導前(0h)和誘導后2、4、6、8?h吸取2mL菌樣于4℃，5000?rpm離心5?min，收集細菌沉淀，用PBS重懸洗滌2次，加入40μl的1×SDS上樣緩沖液，煮沸7?min，冰浴2?min，12000rpm離心5分鐘，同時設立帶pET-32a質粒的BL21大腸桿菌對照；

同時，將剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加1?mL裂解緩沖液、10?μl溶菌酶，將40ml菌液濃縮至4ml，超聲波裂解濃縮菌液后12000?rpm離心1?min，沉淀用PBS重懸加入40μl的1×SDS上樣緩沖液，上清加入等量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5?min，冰浴2?min，-20℃備用。

3.根據權利要求2所述的簡單異尖線蟲Ani?s?4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于：超聲波裂解濃縮菌液的條件為200?w，處理4?s，間隔4?s，共99次。

4.根據權利要求1或2或3所述的簡單異尖線蟲Ani?s?4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于：RT-PCR擴增的反應體系為：10×PCR?buffer?5μl，10mM?dNTPs?4μl，ANCE-Up?1μl，ANCE-Down?1μl，cDNA?2μl，ddH2O???????36.5μl，5?U/μl?Taq酶??0.5μl，總體積??50.0μl；擴增程序：94℃?5min→94℃?30sec，55℃?30sec，72℃1min，30個循環→72℃?10min。