[發明專利]一種簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達方法

在審

• 申請號: 201410027151.6
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103993004A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 李孝軍;王素華;張明哲;杜愛芳;陳璐敏;周圓;洪青林;唐行忠
• 申請（專利權）人: 舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;C07K14/44
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種簡單異尖線蟲Ani?s4抗原基因的克隆和表達方法。?

背景技術

排泄分泌抗原(ES抗原)是在寄生蟲的感染過程中，由其口器和排泄孔分泌或排泄的抗原物質。線蟲的ES系統有許多功能，包括滲透調節、離子調節及排泄、分泌等。分泌的物質在體外可以降解細胞基質，破壞宿主組織，引起臨床的過敏反應，如麻疹和水腫。運用分子克隆技術獲得純化的重組寄生蟲抗原，其有效性和特征性已經在許多寄生蟲感染的診斷中得到了印證。這些合成的蛋白包括了寄生生活及感染過程中的分泌排泄抗原―ES抗原。?

相關研究表明，簡單異尖線蟲三期幼蟲可以侵入宿主的胃腸黏膜釋放ES蛋白。Anis4是簡單異尖線蟲的一個抗原基因，相關研究結果顯示，體外表達的該蛋白具有ES蛋白性質，其具有高度的耐熱性，表達的抗原中不包含糖基化作用。該抗原蛋白經過長時間的加熱，仍然能夠識別在人體病原感染病例中的陽性血清樣本，所以研究認為該蛋白與臨床檢測相關。在應用該抗原檢測人體感染病例研究中，顯示Ani?s4表達抗原能與大部分病人血清產生特異反應。天然的ES蛋白獲得具有非常大的難度，且國內尚無Ani?s4基因體外表達的相關方法報道。鑒于Ani?s4基因的抗原特性以及表達ES蛋白良好的免疫原性和保護效果，本發明研究對其進行克隆和表達，作為深入研究簡單異尖線蟲相關檢測的工具。?

發明內容

本發明提供一種簡單異尖線蟲Ani?s4抗原基因的克隆和表達方法。?

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：?

一種簡單異尖線蟲Ani?s4抗原基因的克隆和表達方法，包括如下步驟：?

①簡單異尖線蟲總RNA的提取，?

②簡單異尖線蟲Ani?s4抗原基因的RT-PCR擴增，?

根據Ani?s4抗原基因其閱讀框的序列特點，在序列的兩端分別加上BamH?I和Hind?Ш酶切位點設計引物，同時增加保護性堿基；設計的引物如下：?

上游引物5'—CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3'（SEQ?ID?NO.1），?

下游引物5'—CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA—3'（SEQ?ID?NO.2），?

以步驟①提取的總RNA為模板，反轉錄出單鏈cDNA，經PCR擴增，獲得目的基因Ani?s4，?

③將純化后的目的基因PCR產物和pMD18-T載體進行連接，獲得重組質粒pMD18-T-Ani-s4；?

④原核表達載體的構建和鑒定：?

BamH?I和HindШ雙酶切質粒pMD18-T-Ani-s4和質粒pET-32a，回收所需目的片段，加入T4DNA連接酶進行連接；將連接產物轉化感受態細胞，抽提質粒；再應用質粒轉化大腸桿菌，BamH?I和HindШ雙酶切篩選陽性克隆，命名為pET32a-Ani-s4；?

⑤IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白，?

含重組表達質粒的菌種活化后，將陽性菌接種到含Amp的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至菌液的OD值為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1mmol/L后34℃繼續振蕩培養進行誘導表達；?

誘導表達后通過SDS-PAGE分析，發現有特異性條帶出現，即完成簡單異尖線蟲Ani?s4抗原基因的克隆和表達。?

作為優選，IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白的具體步驟如下：?

含重組表達質粒的菌種活化后，取1ml陽性菌接種到50mL含Amp的LB液體培養基中，于37℃搖床中以195rpm振搖培養，至菌液的OD值約為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1mmol/L后34℃繼續振蕩培養，分別在誘導前(0h)和誘導后2、4、6、8h吸取2mL菌樣于4℃，5000rpm離心5min，收集細菌沉淀，用PBS重懸洗滌2次，加入40μl的1×SDS上樣緩沖液，煮沸7min，冰浴2min，12000rpm離心5分鐘，同時設立帶pET-32a質粒的BL21大腸桿菌對照；?

同時，將剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加1mL裂解緩沖液、10μl溶菌酶，將40ml菌液濃縮至4ml，超聲波裂解濃縮菌液后12000rpm離心1min，沉淀用PBS重懸加入40μl的1×SDS上樣緩沖液，上清加入等量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，冰浴2min，-20℃備用。?

作為優選，超聲波裂解濃縮菌液的條件為200w，處理4s，間隔4s，共99次。?