[發(fā)明專利]一種4α-羥基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410026879.7
• 申請日: 2014-01-20
• 公開（公告）號: CN103940936A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭久合;吳丹;張鐵柱
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市敬業(yè)精細化工有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 天津市新天方有限責任專利代理事務(wù)所 12104
• 代理人: 李桂英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析領(lǐng)域，涉及一種4α-羥基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的檢測方法。

背景技術(shù)

4α-羥基-L-脯氨酸是合成多個第二代碳青霉烯類抗生素及其它藥物的起始原料，現(xiàn)行制備4α-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)工藝不可避免地會伴生痕量的L-脯氨酸，而L-脯氨酸會參與后續(xù)反應(yīng)，產(chǎn)生影響最終產(chǎn)物含量的雜質(zhì)。4α-羥基-L-脯氨酸和L-脯氨酸均為環(huán)烷羧酸，結(jié)構(gòu)中無紫外發(fā)色基團，因此無法直接用具紫外檢測器的高壓液相色譜儀檢測其純度和含量。

4α-羥基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的分析檢測方法主要有化學比色法、電泳法、氨基酸分析儀測定法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。化學比色法、電泳法及氨基酸分析儀法操作復(fù)雜，分析時間短，分析時間長，價格昂貴。液質(zhì)聯(lián)用法儀器普及性不廣。而柱前衍生與高效液相色譜相結(jié)合具有其操作簡單、分析時間短，方法靈敏、線性范圍寬，結(jié)果準確可靠及普及型廣等優(yōu)點，因此是分析檢測4α-羥基-L-脯氨酸的最有力工具。

高效液相色譜柱前衍生4α-羥基-L-脯氨酸常用的衍生劑有異硫氰酸苯酯(PITC)、2,4二硝基氟苯(DNFB)、9-芴基甲氧羥酰氯(FMOC)等。但是異硫氰酸苯酯(PITC)操作較復(fù)雜，且衍生化時間過長；2,4二硝基氟苯(DNFB)室溫下即融化，影響操作，且衍生出的副產(chǎn)物影響分離結(jié)果；9-芴基甲氧羥酰氯(FMOC)易水解，影響分離，效果欠佳。因此目前，對4α-羥基L-脯氨酸的分析檢測缺乏快速、準確的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種4α-羥基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的檢測方法，即一種衍生方法工時短、能耗低、工藝條件溫和，操作簡便、安全、高效，靈敏度高的檢測4α-羥基-L-脯氨酸的新的方法。

為實現(xiàn)上述的發(fā)明目的，本發(fā)明采取的實施方式如下：

一種4α-羥基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的檢測方法，其包括以下步驟：

（1）取4α-羥基-L-脯氨酸及L-脯氨酸對照品加水溶解，制得4α-羥基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合標準品溶液；

（2）取4α-羥基-L-脯氨酸樣品加水溶解，制得樣品溶液；

（3）將步驟1及步驟2所得混合標準品溶液及樣品溶液分別加入氯甲酸對硝基芐酯二氯甲烷溶液，混勻，靜止后分別取上層溶液稀釋，得衍生化后的4α-羥基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合標準品溶液和衍生化后的4α-羥基-L-脯氨酸樣品溶液；

（4）吸取步驟3獲得的衍生化后的4α-羥基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合標準品溶液和衍生化后的4α-羥基-L-脯氨酸樣品溶液注入液相色譜儀中，進行4α-羥基-L-脯氨酸測定，其中，色譜條件為：

流動相：0.1%磷酸水溶液:乙腈=1:1（v/v）；

色譜柱：Agilent?HC-C18,4.6×250mm,5μm；

流速：1.0mL/min；

進樣量：5μL；

檢測器：VWD；

（5）根據(jù)步驟4所得的色譜圖計算4α-羥基-L-脯氨酸樣品中4α-羥基-L-脯氨酸及L-脯氨酸含量。

具體為稱取2g4α-羥基-L-脯氨酸樣品置于25ml容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，制得4α-羥基-L-脯氨酸樣品溶液；取制得的4α-羥基-L-脯氨酸樣品溶液0.5ml，置于25ml容量瓶中，加入0.5ml50%氯甲酸對硝基芐酯的二氯甲烷溶液，強力振蕩10min，再加入1ml1mol/L?NaOH，振蕩1min，最后加純化水稀釋至刻度，靜止備用。得到對應(yīng)的衍生物1-對硝基芐氧羰基-4α-羥基-L-脯氨酸鈉(痕量的1-對硝基芐氧羰基-L-脯氨酸鈉)，該衍生物均具有紫外吸收，再用高壓液相色譜儀進行檢測分析。

本發(fā)明所涉及部分化合物的結(jié)構(gòu)式：

4α-羥基-L-脯氨酸的結(jié)構(gòu)式如下所示

L-脯氨酸的結(jié)構(gòu)式如下所示

氯甲酸對硝基芐酯的結(jié)構(gòu)式如下所示

1-對硝基芐氧羰基-4α-羥基-L-脯氨酸的結(jié)構(gòu)式如下所示

1-對硝基芐氧羰基-L-脯氨酸的結(jié)構(gòu)式如下所示

本發(fā)明的反應(yīng)原理如下：

本發(fā)明的有益效果是：采用本發(fā)明所述的方法，工時短、能耗低、工藝條件溫和，操作簡便、安全、準確，高效，重現(xiàn)性好，靈敏度高。