[發(fā)明專利]一種橙皮苷類免疫親和柱的制備及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410025361.1
• 申請(qǐng)日: 2014-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN104784972B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉麗娜;金紅宇;馬雙成;王瑩;王濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號(hào): B01D15/38
• 分類號(hào): B01D15/38;G01N1/34;G01N30/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

一種橙皮苷類免疫親和柱的制備及其應(yīng)用，屬于利用生物技術(shù)方法進(jìn)行食品藥品質(zhì)量控制領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

陳皮為常用中藥材，應(yīng)用較為廣泛，有理氣健脾，燥濕化痰的功效，《中國藥典》2010年版一部中以陳皮為處方成分的中藥制劑達(dá)129種，但由于成方制劑成分復(fù)雜，干擾嚴(yán)重，所以多數(shù)含陳皮的中藥制劑中尚未建立陳皮中有效成分橙皮苷類成分的質(zhì)控方法。

中藥基質(zhì)成分復(fù)雜，有效成分含量低，樣品前處理凈化技術(shù)很大程度上決定著分析的成敗。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代儀器分析與檢測(cè)技術(shù)的效率與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比有了大幅度提高，但樣品前處理凈化方式依然多為傳統(tǒng)的液液萃取，柱層析等粗獷方式，使得樣品前處理與檢測(cè)技術(shù)之間的差距越來越大，樣品的前處理已成為現(xiàn)代分析的瓶頸。

傳統(tǒng)的凈化方式需要使用大量的有機(jī)溶劑，缺乏選擇性，費(fèi)時(shí)繁瑣。針對(duì)不同基質(zhì)還可能需要設(shè)計(jì)不同的方法，使得雖然針對(duì)相同成分，但在不同中藥制劑中，檢測(cè)技術(shù)卻較難統(tǒng)一。

免疫親和層析將生物技術(shù)與固相萃取相結(jié)合，根據(jù)待測(cè)物與抗體之間有選擇性的和可逆的相互作用從而將分析物從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中分離出來。免疫親和層析作為樣品的前處理方法，集分離、凈化和濃縮功能于一體，簡化了分離凈化等復(fù)雜的前處理步驟；選擇性好，專屬性強(qiáng)，選擇性的吸附目標(biāo)成分，延長了儀器及色譜柱的使用壽命；簡單、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，減少了有機(jī)溶劑的使用；便于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化操作。

發(fā)明內(nèi)容:

本發(fā)明涉及應(yīng)用可特異性識(shí)別橙皮苷類的抗體來制備一種橙皮苷類免疫親和柱及其應(yīng)用。其目的是將橙皮苷類成分從復(fù)雜的基質(zhì)中分離出來，可以使復(fù)雜的前處理方法變得簡單，有效去除干擾成分，解決因?yàn)榛|(zhì)多樣、干擾嚴(yán)重而不能將同一提取凈化方法、色譜條件應(yīng)用于不同制劑和藥材的問題，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)將藥材及含有該藥材的成方制劑的含量測(cè)定方法統(tǒng)一。

為了達(dá)到上述目的，在本發(fā)明中，制備出了橙皮苷類載體，再用交聯(lián)劑將載體進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)后的載體裝柱后就形成了高親和力的橙皮苷類免疫親和柱。該親和柱操作簡便，純化橙皮苷類成分效率高。樣本經(jīng)過簡單的處理后就可以進(jìn)行純化，得到純度很高的橙皮苷類成分。用于含陳皮中藥制劑的質(zhì)量控制。

具體操作如下：

1.載體活化

選擇瓊脂糖載體，sepharose4B，以環(huán)氧氯丙烷活化法進(jìn)行活化。

取2%的預(yù)溶脹的瓊脂糖凝膠sepharose4B，用20倍體積的蒸餾水充分沖洗，洗去殘存的乙醇，用漏斗過濾掉水分。

稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的環(huán)氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氫化鈉NaBH₄ 5毫升，在25℃下?lián)u床反應(yīng)8小時(shí)。

反應(yīng)后，用大量的蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環(huán)氧氯丙烷。

2.抗橙皮苷類抗體與蛋白G-sepharose載體連接

將抗體連接于瓊脂糖上。將抗橙皮苷類抗體溶于20mM PH7.4的PBS中，終濃度2mg/ml。將抗體加入用20Mm PH7.4的PBS緩沖液洗滌過的凝膠中。室溫結(jié)合30分鐘。

結(jié)合后的載體用PBS洗滌。連接有抗體的載體命名為抗體—sepharose。

3.載體交聯(lián)

將抗體—sepharose用0.1M PH9.0的硼酸緩沖液洗滌3次。然后加入0.1M PH9.0的硼酸緩沖液，在緩沖液中加入交聯(lián)劑如庚二亞氨酸二甲酯（DMP）至終濃度20mM。室溫交聯(lián)1小時(shí)。

加入50mM PH9.0 的乙醇胺終止反應(yīng)。并用50mM的乙醇胺封閉10分鐘。

交聯(lián)后的抗體—sepharose載體用20mM PH7.4的PBS洗滌3次。

4.裝柱

將交聯(lián)后的抗體—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的橙皮苷類親和純化柱。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特異性強(qiáng)，純化效果顯著。該橙皮苷類免疫親和層析柱可提高富集和純化的效率。

附圖說明

圖1：橙皮苷類免疫親和柱結(jié)構(gòu)示意圖

A：進(jìn)樣口； B：柱體； C：篩板； D：橙皮苷類抗體-sepharose填料 E：篩板； F：出樣口

圖2：舒肝止痛丸的HPLC圖譜（未使用本發(fā)明提供的橙皮苷類免疫親和柱凈化）

圖3：舒肝止痛丸的HPLC圖譜（使用本發(fā)明提供的橙皮苷類免疫親和柱凈化）

圖4：益氣養(yǎng)血口服液的HPLC圖譜（未使用本發(fā)明提供的橙皮苷類免疫親和柱凈化）