[發明專利]一種檢測柑桔黃脈病毒的引物對及檢測方法

無效

• 申請號: 201410025175.8
• 申請日: 2014-01-20
• 公開（公告）號: CN103757135A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 陳洪明;李中安;王雪峰;周彥;唐科志;周常勇
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 余明偉

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，特別是涉及一種柑桔黃脈病毒的引物對及快速檢測方法。

背景技術

柑桔黃脈病（Citrus?yellow?vein?clearing?disease,CYVCD），也稱檸檬黃脈病（Yellow?vein?clearing?of?Lemon），是由柑桔黃脈病毒（Citrus?yellow?vein?clearing?virus,CYVCV）引起的。該病是Bové（1989）在巴基斯坦調查發現后命名的，它是威脅檸檬生產的重要病害之一。主要癥狀表現為葉片側脈及側脈附近脈明、黃化，對光看更為明顯，葉背可見側脈處水浸狀，部分葉片皺縮、反卷或船形葉，嫩葉癥狀表現明顯，到老葉癥狀也不消失。主要導致光合作用降低、樹勢減弱、減產20%左右。檸檬黃脈病目前主要發生在印度、巴基斯坦、土耳其等國家。近年在我國云南瑞麗、重慶也發生類似癥狀，是我國柑桔上的新發病害。

到目前為止，世界上對該病害的研究較少，大都停留在生物學特性研究方面，本人近幾年研究結果表明該病害具有嫁接傳染性，對所有檸檬、酸橙品種都具有嫁接傳染性并具典型癥狀，對甜橙、寬皮柑桔也具有侵染性，但癥狀不明顯；能侵染辣椒和豇豆；柑桔黃脈病最適宜發病溫度為18～24℃，柑桔黃脈病病毒微粒為13～15×400～1000nm聯合絲狀，通過熱處理結合莖尖嫁接脫毒方法能有效脫除該病毒。這些研究結果與國外研究報道的相關結果相同。

但由于通過指示植物鑒定具有時間長，工作量大，不利于田間樣品的大量檢測。且到目前為止，國內尚無RT-PCR快速檢測柑桔黃脈病毒的方法報道。

發明內容

本發明的目的是建立一種柑桔黃脈病毒快速檢測方法。該方法具有速度快、成本低、重復性好、穩定性高、操作性強等特點，適合大規模、高通量的樣品分析，適用于田間樣品檢測、柑桔黃脈病流行監控、脫毒苗木鑒定等多種用途。

本發明的目的是這樣實現的：

本發明目的之一，根據已報道的柑桔黃脈病毒全序列設計特異性引物對：

上游引物：5’-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3’

下游引物：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’

總核酸提取及(RT)-PCR擴增所需試劑如下：

RNAiso?Plus1ml，氯仿200μL，異丙醇，75%乙醇，DEPC水，2×Buffer液5μL，MgSO40.3μL，RT/Taq酶0.2μL，正反引物各0.2μL，滅菌去離子水2.1μL。

(RT)-PCR擴增條件為：42℃，30min；94℃，2min；94℃，30S，55℃，30S，72℃，40S，40個循環；72℃，5min。

本發明的目的還在于提供一種柑桔黃脈病毒檢測的試劑盒，包括下列引物對：

上游引物：5’-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3’

下游引物：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’。

本發明的目的還在于提供一種快速檢測柑桔黃脈病毒的RT-PCR的檢測方法，包括如下步驟：提取柑桔樣品總核酸，設計特異性引物，對待測樣品進行RT-PCR擴增，最后電泳鑒定：

所述RT-PCR擴增所需試劑如下：

RNAiso?Plus1ml，氯仿200μL，異丙醇，75%乙醇，DEPC水，

2×Buffer液5μL，MgSO40.3μL，RT/Taq酶0.2μL，正反引物各0.2μL，滅菌去離子水2.1μL；

RT-PCR擴增條件為：程序為42℃，30min；94℃，2min;94℃，30S，55℃，30S，72℃，40S，40個循環；72℃，5min。

優選的，所述提取樣品總核酸，樣品主要取春、秋梢嫩葉葉脈及附近組織。

所述電泳鑒定得到的特異性片段大小為612bp。

本發明具體按如下步驟進行：

1、總核酸提取：

（1）取樣、研磨：

由于CYVCV癥狀主要表現春季和秋季的葉片上，尤其在嫩葉上，故采樣嫩葉葉脈及附近組織10-15mg裝于無菌eppendorf管，液氮研磨；