[發明專利]一種巴馬小型豬精原干細胞誘導精子細胞的方法

無效

• 申請號: 201410024686.8
• 申請日: 2014-03-31
• 公開（公告）號: CN103820383A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 趙會敏;盧克煥;盧盛晟;陸陽清;楊小淦;楊歡;李敏霞;張颯
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 彭曉玲

技術領域

本發明涉及一種巴馬小型豬精原干細胞誘導精子細胞的方法，屬于干細胞生物工程。

背景技術

2002年，Li-Xin?Feng等利用干細胞因子（stem?cell?factor）誘導小鼠精原干細胞產生了精子細胞（Feng?LX,Chen?Y,Dettin?L,Pera?RA,Herr?JC,Goldberg?E,et?al.Generation?and?in?vitro?differentiation?of?a?spermatogonial?cell?line.Science.2002Jul19;297(5580):392-5）；2003年，Fariborz?Izadyar等將牛的A型精原細胞在體外長期培養，誘導出精子細胞（Izadyar?F,Den?Ouden?K,Creemers?LB,Posthuma?G,Parvinen?M,De?Rooij?DG.Proliferation?and?differentiation?of?bovine?type?A?spermatogonia?during?long-term?culture.Biol?Reprod.2003Jan;68(1):272-81.）；2006年，Jae?Ho?Lee等將大鼠睪丸細胞在用膠原制作的三維培養基中培養，組織可以進行精子發生（Lee?JH,Kim?HJ,Kim?H,Lee?SJ,Gye?MC.In?vitro?spermatogenesis?by?three-dimensional?culture?of?rat?testicular?cells?in?collagen?gel?matrix.Biomaterials.2006May;27(14):2845-53.）；2006年，Karim?Nayernia等利用小鼠的胚胎干細胞誘導出雄性單倍體細胞（Nayernia?K,Nolte?J,Michelmann?HW,Lee?JH,Rathsack?K,Drusenheimer?N,et?al.In?vitro-differentiated?embryonic?stem?cells?give?rise?to?male?gametes?that?can?generate?offspring?mice.Dev?Cell.2006Jul;11(1):125-32.）；2006年，Dong?Ryul?Lee等從精子活力缺乏病人的睪丸中分離出類精原干細胞，在維甲酸、睪酮和促卵泡素的作用下誘導出了精子細胞（Lee?DR,Kim?KS,Yang?YH,Oh?HS,Lee?SH,Chung?TG,et?al.Isolation?of?male?germ?stem?cell-like?cells?from?testicular?tissue?of?non-obstructive?azoospermic?patients?and?differentiation?into?haploid?male?germ?cells?in?vitro.Hum?Reprod.2006Feb;21(2):471-6.）；2011年，Sato,Takuya等在瓊脂糖凝膠塊上培養新生小鼠的睪丸組織，并產生了精子（Sato?T,Katagiri?K,Gohbara?A,Inoue?K,Ogonuki?N,Ogura?A,et?al.In?vitro?production?of?functional?sperm?in?cultured?neonatal?mouse?testes.Nature.2011Mar24;471(7339):504-7.）。現有的技術多是針對小鼠、牛和人，沒有發現從豬的精原干細胞中誘導出精子細胞。

發明內容

本發明的目的在于提供一種巴馬小型豬精原干細胞誘導精子細胞的方法，通過精原干細胞在體外擴增、誘導出精子細胞。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種巴馬小型豬精原干細胞誘導精子細胞的方法，包括配制培養基、制作STO飼養層、精原干細胞誘導精子細胞、精子細胞鑒定四個步驟，其中：所述配制培養基包括配制STO培養液和精原干細胞培養液，STO培養液由基礎培養基DMEM/F12、FBS、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素組成；精原干細胞培養液由基礎培養基DMEM/F12、BSA、丙酮酸鈉、B27添加物、GDNF、bFGF、GFRα1、β-巰基乙醇、青霉素、鏈霉素組成。

優選的是：所述的STO培養液中FBS加入量為7%DMEM/F12體積，每毫升DMEM/F12加入0.1mmolβ-巰基乙醇、55ng丙酮酸鈉、100U青霉素、100μg鏈霉素。