[發明專利]一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201410023622.6
• 申請日: 2014-01-19
• 公開（公告）號: CN103804494A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 許文濤;朱龍佼;黃昆侖;何景;羅云波;翟百強;董凱
• 申請（專利權）人: 北京福德安科技有限公司;中國農業大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法。?

背景技術

第一起蠟樣芽孢桿菌食物中毒早在1906年就有報告。但直至1950年才明確其病因，之后許多國家，特別是北歐、東歐國家也報告了類似的中毒癥。1960～1968年間在匈牙利細菌性食物中毒中，蠟樣芽孢桿菌為第三個最常見的致病菌，該菌所致食物中毒為已報告食物中毒起數的84％，中毒人數占總中毒人數的14.8%。1971年以來，英國報告過多起該菌食物中毒。我國南京市衛生防疫站于1973年首次報告了南京某托兒所兒童因進食泡飯引起嘔吐型蠟樣芽孢桿菌食物中毒。現今除西藏外，各省、市已相繼報告該菌食物中毒。蠟樣芽孢桿菌食物中毒涉及的食品種類多,在我國發生的蠟樣芽孢桿菌食物中毒多與米飯或淀粉類制品有關。據調查，食物的帶菌率最高可達70%,誤食帶有大量活菌及其腸毒素的食物后可引起嘔吐型或腹瀉型腸胃炎，對人類的健康有著極大的危害，為提高食品安全性，建立一種快速靈敏的檢測方法十分必要，具有極大的科研及應用價值。目前蠟樣芽孢桿菌復溶檢測方法主要有?

細菌學檢測方法?

傳統的細菌學檢測主要依據菌落的形態特征和其生理特性，如菌落是否灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，菌落較大等特征進行甄別、檢測。根據這特性設計的一系列試驗均可對蠟樣芽孢桿菌進行鑒定，無需測試其它生化指標。但是需長時間進行選擇性增菌，整個過程耗時較長。。極大限制了在食品加工中對該菌污染的有效監控。?

免疫學檢測?

傳統的血清學反應如單向/雙向擴散技術、間接血凝技術、對流免疫瓊脂凝膠泳技術，補體結合試驗等雖然操作簡便，但是影響因素因素太多，且費時，敏感差。因此，更多新的免疫學檢測技術應運而生，包括酶聯免疫吸附(ELISA)、疫熒光(Ⅲ)、放射免疫法(RIA)、流式細胞分析(FCM)、免疫電化學發光(IECL)等。這些免疫學檢測方法都建立在抗原抗體特異結合的基礎上，同時利用熒光，放射性，酶標等顯色技術而達到檢測目的。這些方法特異性、重復性以及敏感性較好，且結合物高度穩定、有效期長、儀器設備簡單，因而廣泛應用于實驗室研究。而這些方法的基石在獲得一株特異性好靈敏度高的臘樣芽胞桿菌的抗體，本專利針對此問題建立了一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，為蠟樣芽孢桿菌快速高特異性檢測方法的建立奠定基礎。?

發明內容

發明目的：本發明的目的是提供一種高效的蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法。?

技術方案：本發明提供的一種蠟樣芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：?

1)富集：首先將0.5～1ml的-80℃凍存的蠟樣芽孢桿菌的菌種加入到20～40ml?Luria～Bertani液體培養基中，36～38℃恒溫搖床150～250rpm震蕩過夜，將蠟樣芽孢桿菌的菌種活化，取50～150ul活化好的菌種用涂布法將其均勻涂布在Luria～Bertani固體培養基表面，36～38℃恒溫培養箱，培養12～24h，當培養的蠟樣芽孢桿菌的菌體數量可以完全覆蓋平板時，用2～3ml濃度為0.9%的生理鹽水，借助無菌的涂布棒輕輕刮板，避免將培養基刮下，收集洗滌液制備菌液，7000～9000rpm/min高速離心5～10min，棄上清，得到菌富集沉淀，0.9%的生理鹽水洗滌沉淀，洗滌次數為3～5次。?

2)固定：指將菌沉淀首先浸潤于液氮5～10min，然后快速完全溶解于5ml濃度為0.9%的生理鹽水，置于沸水浴變加熱邊震蕩15～20min，使得臘樣芽胞桿菌的表面成分固定，抗原決定簇充分暴露，制備得到菌抗原。?

3)乳化：將一定濃度的固定好的蠟樣芽孢桿菌的生理鹽水懸浮液，分別添加一定劑量的氟氏佐劑及RIBI?佐劑，利用自組裝乳化儀自組裝乳化儀將混合物處理30～50min得到均勻的乳化液。?

4)免疫：將制備得到的乳化液，以氟氏完全佐劑組注射背部多位點為主，以RIBI佐劑組注射腹股溝、腋窩、腳蹼的外周位點為輔注射1～2月齡，重約2～3Kg雌性新西蘭大白兔背部平行的八個位點，免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為5×10⁸～10×10⁸cfu/ml，用量為0.5～2ml，每個位點注射200～300ul；腹股溝、腋窩、腳蹼外周位點免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為1×10⁸～5×10⁸cfu/ml，用量為0.5～2ml；免疫間隔設置為首次免疫與第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射間隔時間為5～9d，2～4d，2～4d，2～4d。?