[發(fā)明專利]一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410023622.6
• 申請日: 2014-01-19
• 公開（公告）號: CN103804494A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許文濤;朱龍佼;黃昆侖;何景;羅云波;翟百強;董凱
• 申請（專利權(quán)）人: 北京福德安科技有限公司;中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/06
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1.一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備，其特征在于，包括以下步驟：?

(1)富集：首先將蠟樣芽孢桿菌的菌種活化，利用培養(yǎng)基將活化的蠟樣芽孢桿菌菌種富集到一定的數(shù)量，洗滌制備菌液，高速離心，棄上清，得到菌富集沉淀，并用生理鹽水洗滌沉淀；?

(2)固定：使用改良型沸水浴加熱方法，使得蠟樣芽胞桿菌的表面成分固定，抗原決定簇充分暴露，制備得到菌抗原；?

(3)乳化：將固定好的蠟樣芽孢桿菌的生理鹽水懸浮液調(diào)至合適菌濃度，分別添加一定劑量的佐劑1及佐劑2，利用自組裝乳化儀處理分層混合物得到均勻的乳化液；?

(4)免疫：將制備得到的乳化液，以背部多位點為主，以腹股溝、腋窩、腳蹼的外周位點為輔的肌肉注射方式，及短免疫間隔方式，注射到新西蘭大白兔體內(nèi)；?

(5)抗血清效價：采用ELISA方法評估抗血清效價，符合標準后，對大白兔進行加強免疫，準備取全血；?

(6)取全血：采用水合氯醛對大白兔進行麻醉，從頸部動脈取全血；?

(7)抗血清制備：將兔全血在合適的溫度靜置，使抗血清自然層析，然后采用高速離心的方法將抗血清從全血中分離出來；?

(8)純化：利用正辛酸飽和硫酸銨法，從兔血清中制備得到抗蠟樣芽孢桿菌的多克隆抗體。?

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備，其特征在于：步驟（1）中，所述的菌種活化方法是將0.5～1mL的-80℃凍存的蠟樣芽孢桿菌的菌種加入到20～40mL?Luria～Bertani液體培養(yǎng)基中，36～38℃恒溫搖床150～250rpm震蕩過夜。富集活化菌種的培養(yǎng)基是Luria～Bertani固體培養(yǎng)基，富集方法是取50～150ul活化好的菌種用涂布法將其均勻涂布在Luria～Bertani固體培養(yǎng)基表面，36～38℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12～24h。?

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，一定數(shù)量是指當(dāng)培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌的菌體數(shù)量可以完全覆蓋平板時，且菌層厚度為2～3mm；洗滌用液是2～3mL濃度為0.9%的生理鹽水，洗滌方式是用無菌的涂布棒進行刮板，操作要輕，避免將培養(yǎng)基刮下，收集洗滌液。?

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，高速離心操作是指7000～9000rpm/min，離心5～10min，洗滌沉淀的方式是將菌沉淀輕輕彈起洗滌，洗滌次數(shù)為3～5次，洗滌液是濃度為0.9%的生理鹽水。?

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，改良型沸水浴加熱方法是指將菌沉淀首先浸潤于液氮5～10min，然后快速完全溶解于5mL-10mL濃度為0.9%的生理鹽水中，置于沸水浴邊加熱邊震蕩15～20min。?

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟（3）中，佐劑1是氟氏佐劑，佐劑2是RIBI佐劑，氟氏完全佐劑是用于背部皮下多位點免疫，RIBI佐劑是用于腹股溝、腋窩、腳蹼外周位點免疫注射；兩種佐劑的用量均為0.5～2mL，背部多位點免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為5×10⁸～10×10⁸cfu/mL，用量為0.5～2mL；腹股溝、腋窩、腳蹼外周位點免疫注射菌抗原懸浮液的濃度為1×10⁸～5×10⁸cfu/mL，用量為0.5～2mL。?

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟（3）中，短免疫間隔是指首次免疫與第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射間隔時間為5～9d，2～4d，2～4d，2～4d。自組裝乳化儀包括迷你電機其可承受轉(zhuǎn)速為8000～12000rpm，迷你變壓器其可將220V電壓轉(zhuǎn)換為10～1.0V的小電壓、自制轉(zhuǎn)子具有反向齒輪、自制乳化管可以裝載2～7mL混合物體積；乳化時間為30～50min。?

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟（4）中，新西蘭大白兔為1～2月齡，重約2～3Kg的雌性大白兔，多位點為背部平行的八個位點，每個位點注射200～300ul。?