[發明專利]一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌

有效

• 申請號: 201410023123.7
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103725699A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 趙志軍;史吉平;孫俊孫;何曉娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海高等研究院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/08;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 張艷

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌。

背景技術

過氧化氫酶（Catalase，簡稱CAT），催化分解過氧化氫為水和氧氣。CAT廣泛應用于食品、紡織、造紙和醫藥等行業，其中在紡織工業中主要用于布料漂白后殘余H₂O₂的消除。與傳統工藝的水洗或化學助劑相比，CAT具有減少污染、提高后續印染質量等優點；但值得關注的是，印染工序通常是在高溫（T>70℃）堿性（pH>9）環境中進行的，這就需要CAT具備嗜熱嗜堿的應用特性。盡管CAT來源豐富，幾乎存在于所有的需氧微生物中，但市場上目前仍缺乏具備優良紡織應用特性的CAT。

過氧化氫酶按催化中心結構差異可分為兩類：（1）含鐵卟啉環結構CAT，又稱鐵過氧化氫酶（FeCAT）；（2）由錳離子代替鐵離子的卟啉結構，又稱錳過氧化氫酶（MnCAT），目前已發現約280種FeCAT和30種MnCAT。近年來，研究者發現個別來源于高溫堿性環境中的古細菌可以產生具有嗜熱嗜堿特性的MnCAT，例如：Metallosphaera?hakonensis來源的MnCAT，在pH8.0-10.0環境中處理60min酶活損失小于20%；在70℃下處理50min，酶活殘留率約在60%(Alkali-tolerant?high-activity?catalase?from?a?thermophilic?bacterium?and?its?overexpression?in?Escherichia?coli,Protein?expression?and?purification,2008.57(2):255-260.)。但目前這類嗜熱MnCAT的研究仍處于初級階段，國外文獻報道的該類MnCAT最高發酵酶活力僅約為20U/ml，而國內還未見其相關報道（Non-heme?manganese?catalase–the‘other’catalase,Archives?of?biochemistry?and?biophysics,2012,525:111-120.）。

發明內容

本發明鑒于上述情況，根據大腸桿菌密碼子使用偏愛性，對Thermus?thermophilus?HB27來源的錳過氧化氫酶基因序列進行密碼子優化，提供一種嗜熱堿性重組含錳過氧化氫酶及其表達載體和工程菌，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸，其序列如SEQ?ID?No：1所示。

所述多核苷酸序列根據Thermus?thermophilus來源的錳過氧化氫酶基因核苷酸序列，按照大腸桿菌（Escherichia?coli）密碼子使用偏愛性（http://gcua.schoedl.de/seqoverall_v2.html）優化設計。

本發明第二方面提供一種重組含錳過氧化氫酶，由所述的多核苷酸序列編碼。

本發明第三方面提供一種重組含錳過氧化氫酶表達載體（pET28a-MnCAT），包含所述重組含錳過氧化氫酶的多核苷酸序列。

優選的，所述表達載體為pET系列表達載體。

更優選的，所述pET系列表達載體為pET28a(+)。所述pET28a(+)購自Novagen公司。

本發明第四方面提供一種工程菌（BL21(DE3)/pET28a-MnCAT），所述工程菌由所述重組含錳過氧化氫酶表達載體（pET28a-MnCAT）轉化獲得。

優選的，所述工程菌由所述重組含錳過氧化氫酶表達載體轉化大腸桿菌獲得。

更優選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明第五方面提供所述重組含錳過氧化氫酶的制備方法，包括如下步驟：

將所述工程菌在LB培養基中活化過夜后，轉接至TB培養基中，當菌濃OD600達到0.7-0.8時，添加MnCl₂和IPTG，再誘導培養。

所得培養液的菌體破碎上清液中的酶活力可達120U/ml。

進一步的，由于pET28a(+)上含有6-His純化標簽，因此選擇常用的Ni-NTA樹脂親和層析法進行蛋白純化。

優選的，轉接時按1%轉接。

優選的，轉接至含有50μg/ml?Kan的TB培養基中。