[發明專利]一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410022450.0
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103760345A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 石佳;李啟靖;董劍峰;張衛紅
• 申請（專利權）人: 北京曠博生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用，特別涉及一種基于流式細胞術利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染病，據WHO資料估計，全球約三分之一的人口受結核分枝桿菌隱性感染，每年新發活動性感染病例九百多萬，死亡一百萬例以上。近年來，我國結核病發病率居高不下，每年新發病例超過一百萬，死亡近二十萬例，對我國公民的健康、社會的安定和經濟的發展帶來嚴重的危害。

結核病的早期診斷對于控制患者疾病進展和感染的蔓延具有重要意義。目前，結核病臨床診斷仍然缺乏高靈敏度和高特異性的手段。傳統的結核菌素皮下試驗所用的抗原（PPD）因為能夠跟卡介苗（BCG）的接種產生交叉反應使得其產生較高比例的假陽性，而臨床診斷的“金標準”結核菌培養則有時間長，陽性率低等缺陷。另外，基于X射線透射和臨床表現的診斷則特異性較低，容易與其他肺部感染或疾病相混淆。

免疫學研究表明，結核分枝桿菌作為一種胞內寄生菌，其分泌的一些蛋白能夠激發高水平的T細胞免疫反應，而針對這些蛋白中包含的T細胞表位特異性T細胞檢測給TB的診斷帶來了新的機遇。通過結核桿菌與BCG菌株基因組的研究比較發現了在所有BCG菌株中完全缺失的基因片段RD1，針對RD1區編碼的蛋白ESAT-6和CFP-10特異性T細胞分泌產生的IFN-γ的檢測（IGRAs），催生了兩種商品化結核診斷試劑盒，即基于酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）的T-SPOT.TB和基于酶聯免疫吸附技術（ELISA）的QuantiFERON-TB?Gold。目前，這兩種診斷試劑盒已經分別于2007年和2008年在美國得到FDA批準上市，作為結核病臨床診斷的輔助手段。ELISPOT方法需要對外周血樣本進行分離，得到外周血單個核細胞并對細胞進行計數后方可進行后續的抗原刺激等試驗，同時對相關實驗與檢測儀器的要求較高，在臨床單位的普及率不高。

然而，中國特殊的結核病流行病學及生態環境、由于專利保護產生的高成本，使得這些診斷產品并不適用于中國廣泛的臨床診斷應用，因此亟需開發具有自主知識產權的結核病快速診斷試劑。此外絕大多數免疫檢測方法如ELISPOT方法均需要首先從全血中分離外周血單個核細胞并對細胞進行計數后方可進行檢測，因此開發一種利用全血直接進行相關檢測實驗的方法可大大提高相關試劑在臨床的適用性。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒。

本發明所提供的利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒，具體可含有如下物質：

（1）結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；

所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示氨基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成；

（2）經熒光染料A標記的抗CD3的抗體；

（3）經熒光染料B標記的抗γ-干擾素的抗體；

（4）高爾基體阻斷劑；

所述熒光染料A和所述熒光染料B所發熒光顏色不同。

在所述試劑盒中，所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫中的多肽既可為每條獨立包裝，也可按照等質量混合以后一起包裝。

在本發明中，所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示氨基酸序列組成的19條多肽組成。

在所述試劑盒中，還含有說明書；

所述說明書中記載：按照包括如下步驟的方法檢測待測個體是否被結核分枝桿菌感染：

（a）向離體的待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37℃孵育14-18h（如18h）；

（b）向步驟（a）的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37℃孵育4-6h（如6h）；

（c）將步驟（b）的體系離心后，向沉淀中加入細胞固定液，避光反應15-25min（如20min），再加入通透緩沖液；

（d）向步驟（c）的體系中加入所述經熒光染料標記的抗CD3的抗體和所述經熒光染料標記的抗γ-干擾素的抗體，避光反應20-30min（如30min）；

（e）將步驟（d）的體系離心，取細胞沉淀，加入染色緩沖液，進行流式細胞檢測；