[發(fā)明專利]一種利用外周血檢測結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410022450.0
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103760345A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 石佳;李啟靖;董劍峰;張衛(wèi)紅
• 申請（專利權(quán)）人: 北京曠博生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

1.一種利用外周血檢測結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒，含有如下物質(zhì)：

（1）結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；

所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示氨基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成；

（2）經(jīng)熒光染料A標(biāo)記的抗CD3的抗體；

（3）經(jīng)熒光染料B標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體；

（4）高爾基體阻斷劑；

所述熒光染料A和所述熒光染料B所發(fā)熒光顏色不同。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有說明書；

所述說明書中記載：按照包括如下步驟的方法檢測待測個體是否被結(jié)核分枝桿菌感染：

（a）向離體的待測外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37℃孵育14-18h；

（b）向步驟（a）的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37℃孵育4-6h；

（c）將步驟（b）的體系離心后，向沉淀中加入細(xì)胞固定液，避光反應(yīng)15-25min，再加入通透緩沖液；

（d）向步驟（c）的體系中加入所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體，避光反應(yīng)20-30min；

（e）將步驟（d）的體系離心，取細(xì)胞沉淀，加入染色緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測；

（f）結(jié)果判斷：若經(jīng)所述流式細(xì)胞儀檢測，雙陽性細(xì)胞的比例大于0.2%，且為空白對照組中雙陽性細(xì)胞比例的兩倍以上，則所述待測個體被結(jié)核分枝桿菌感染或候選被結(jié)核分枝桿菌感染；反之，則所述待測個體未被結(jié)核分枝桿菌感染或候選未被結(jié)核分枝桿菌感染；

所述對空對照組為：與如上步驟（a）-（f）相比，僅缺少步驟（a）中所述“向待測外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫”的步驟；

所述雙陽性細(xì)胞為被如下兩種抗體同時標(biāo)記的細(xì)胞：所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述熒光染料標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述抗CD3的抗體為抗CD3的單克隆抗體；和/或

所述抗γ-干擾素的抗體為抗γ-干擾素的單克隆抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述經(jīng)熒光染料A標(biāo)記的抗CD3的抗體為經(jīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗CD3的單克隆抗體；和/或

所述經(jīng)熒光染料B標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體為經(jīng)R-藻紅蛋白標(biāo)記的抗γ-干擾素的單克隆抗體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有T細(xì)胞非特異性刺激物；

所述T細(xì)胞非特異性刺激物具體為植物凝集素或刀豆蛋白A。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有細(xì)胞固定液和/或通透緩沖液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有染色緩沖液。

8.權(quán)利要求1-7中任一所述的試劑盒的制備方法，包括將所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫、所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體、所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體和所述高爾基體阻斷劑分別單獨包裝的步驟。

9.權(quán)利要求1-7中任一所述的試劑盒在利用外周血體外檢測結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。

10.一種檢測外周血中是否含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

（a）向離體的待測外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37℃孵育14-18h；

（b）向步驟（a）的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37℃孵育4-6h；

（c）將步驟（b）的體系離心后，向沉淀中加入所述細(xì)胞固定液，避光反應(yīng)15-25min，再加入所述通透緩沖液；

（d）向步驟（c）的體系中加入所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體，避光反應(yīng)20-30min；

（e）將步驟（d）的體系離心，取細(xì)胞沉淀，加入所述染色緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測；

（f）結(jié)果判斷：若經(jīng)所述流式細(xì)胞儀檢測，雙陽性細(xì)胞的比例大于0.2%，且為空白對照組中雙陽性細(xì)胞比例的兩倍以上，則所述待測外周血中含有或候選含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞；反之，則所述待測外周血中不含有或候選不含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞；

所述對空對照組為：與如上步驟（a）-（f）相比，僅缺少步驟（a）中所述“向待測外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫”的步驟；

所述雙陽性細(xì)胞為被如下兩種抗體同時標(biāo)記的細(xì)胞：所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述熒光染料標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體。