[發明專利]高純度膠原蛋白海綿的制備方法

無效

• 申請號: 201410022396.X
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103772734A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 黃玉東;李大龍;賀金梅;程瑋璐;吳亞東;王承旭
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C08J9/28
• 分類號: C08J9/28;C08L89/00;C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及膠原蛋白海綿的制備方法。

背景技術

膠原蛋白是哺乳動物體內含量最多的蛋白質，占體內蛋白質總量的25%～30%，相當于體重的6%，存在于幾乎所有組織中，是一種細胞外基質蛋白，以不溶纖維形式存在，具高度抗張能力，對動物和人體皮膚、血管、骨骼、筋骨、軟骨的形成十分重要，是結締組織的重要物質，是決定結締組織韌性的主要因素。膠原蛋白是一類結構上既有共同特點又有差異的蛋白質家族，目前已發現有27種不同類型的膠原，按照被發現的先后順序分別稱為Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原等，用大寫的羅馬數字來進行命名。膠原蛋白和其他蛋白一樣也是由氨基酸組成的，但在其組成中甘氨酸幾乎占到了1/3，并且脯氨酸和羥脯氨酸是各類蛋白質中最高的，正因為氨基酸的組成特點，膠原蛋白在空間中以穩定的三螺旋結構存在。膠原蛋白具有諸多優異的生物學性質，如低免疫性：膠原分子結構中的重復性單元大，免疫原性非常低，對機體無排異反應，親和性好，一般生物機體不會對其產生慢性的排斥現象。

各種類型的膠原蛋白廣泛分布于機體的所有組織中，不同類型的膠原因分布和含量不同在機體中具有不同的功能。Ⅰ型膠原蛋白是動物體內含量最多的一類膠原，是脊椎動物結締組織中最重要和最常見的的膠原類型。Ⅰ型膠原蛋白目前在組織工程中大量使用，使得從動物組織中提取Ⅰ型膠原蛋白成為了近年來研究的熱點。雖然Ⅰ型膠原蛋白能從動物的許多的組織中提取，但選取適當的組織材料是提取膠原蛋白的首要條件。目前已知動物的跟腱和骨骼的纖維幾乎都是Ⅰ型膠原蛋白，因此選擇動物跟腱組織為原料提取并制得的膠原蛋白海綿是Ⅰ型膠原蛋白為主的，可以減少高純度膠原蛋白海綿制備過程中的提純工藝。

目前從動物組織中提取膠原蛋白一般有兩種方法：使用溶劑的化學法和使用酶的生物化學法。選擇提取膠原的組織材料后要進行預處理，去掉上面的非膠原成分，特別是要用有機溶劑抽提出其中的脂肪組織。由于使用溶劑的化學法容易造成肽鍵的水解，得到的膠原蛋白相對分子質量較低，因此在制備膠原蛋白時通常是使用酶的生物化學法。該法常用于提取膠原蛋白的溶劑有中性鹽和酸性溶劑：中性鹽主要采用Tris-HCl，氯化鈉、檸檬酸鹽等，在中性條件下，膠原蛋白不能溶解在低濃度的鹽溶液中，當鹽的濃度達到一定量時，膠原就會發生溶解，中性鹽做溶劑提取膠原蛋白工藝不穩定是其主要缺點；酸性溶劑多采用弱酸如醋酸、檸檬酸等溶液，主要通過低離子濃度及酸性條件破壞膠原蛋白分子間的鹽鍵和Schiff鍵，引起膠原纖維膨脹、溶解，從而達到提取的目的。酸性溶劑提取膠原蛋白具有水解反應快，無污染，提取的膠原蛋白物理化學性質穩定等優點。一般是在酸性溶劑中，胃蛋白酶催化水解膠原的端肽非螺旋區，對螺旋區無作用，這樣溶解的膠原具有完整的三螺旋結構，更降低了膠原蛋白的抗原性，適用于做生物醫用材料。每種方法提取的膠原蛋白都有雜質，為了分離非膠原物質，在膠原粗提液中加入較多的粉狀鹽將全部膠原沉析出來，進行粗提純，再將沉淀溶解在中性鹽溶液中，進行透析，除去小分子的鹽類雜質，從而得到純度較高的膠原蛋白海綿。

目前市場上已有幾種膠原蛋白海綿應用于臨床，做為組織工程材料和止血材料使用。該類膠原蛋白產品主要是采用酸性溶劑酶的生物化學法進行提取，最后經過鹽析、透析工藝得到膠原蛋白海綿。通過對其產品進行微觀孔形貌和氨基酸分析，電鏡下能明顯看到膠原蛋白產品上吸附一些沒有除去的小分子鹽類，而且氨基酸分析結果顯示，該方法得到的膠原蛋白純度較低。低純度的膠原蛋白海綿，做為止血材料，具有一定止血功能，但作用時間較慢，不具有快速止血的效果。目前的工藝得不到高純度的膠原蛋白海綿主要是由于在透析過程中，采用的是一步透析法，一步法透析過程中小分子鹽類雜質不能完全去除干凈，影響了最后得到的膠原蛋白海綿產品的純度。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有方法制備的膠原蛋白海綿存在生產周期長、產率低、純度低以及止血性能差的問題，而提供了高純度膠原蛋白海綿的制備方法。

高純度膠原蛋白海綿的制備方法，按以下步驟進行：

一、新鮮的牛跟腱預處理：將100～250g新鮮的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗凈切成0.5cm×0.5cm的小塊放入組織搗碎機中，加入300～500ml蒸餾水，開機搗碎，然后用蒸餾水洗滌，再用1000ml質量濃度為0.05%～3%的碳酸鈉溶液浸泡10～24h，過濾，將沉淀在自然狀態下干燥；