[發(fā)明專利]高純度膠原蛋白海綿的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410022396.X
• 申請(qǐng)日: 2014-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103772734A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃玉東;李大龍;賀金梅;程瑋璐;吳亞?wèn)|;王承旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C08J9/28
• 分類號(hào): C08J9/28;C08L89/00;C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 侯靜

1.高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于它按以下步驟進(jìn)行：

一、新鮮的牛跟腱預(yù)處理：將100～250g新鮮的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗凈切成0.5cm×0.5cm的小塊放入組織搗碎機(jī)中，加入300～500ml蒸餾水，開(kāi)機(jī)搗碎，然后用蒸餾水洗滌，再用1000ml質(zhì)量濃度為0.05%～3%的碳酸鈉溶液浸泡10～24h，過(guò)濾，將沉淀在自然狀態(tài)下干燥；

二、膠原蛋白的提取：將5～50g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入500～1500ml質(zhì)量濃度為0.1%～5%的乙酸，攪拌使其溶解，然后加入100～500ml含有0.5～5g胃蛋白酶或者無(wú)花果蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.1%～5%的乙酸，再置于5℃的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取2～4天，獲得提取液；

三、離心：將提取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為-5～5℃，轉(zhuǎn)速為10000～15000轉(zhuǎn)/分，離心20～30min，取離心的上層清液；

四、鹽析：將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為5%～15%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5～8.0，攪拌均勻，然后加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為1.5～5mol/l，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4℃冰箱中靜置12～24h，獲得膠原混合液；

五、溶解：將膠原混合液過(guò)濾，然后用蒸餾水清洗沉淀3～5次，再向過(guò)濾出的膠原沉淀中加入300～500ml的Tris-HCl緩沖溶液，邊加邊攪拌至膠原蛋白完全溶解，然后置于4℃冰箱中靜置24～48h，獲得溶解的膠原溶液；

六、梯度透析：①將溶解的膠原溶液裝入截留分子量為五萬(wàn)的透析袋中，在磁力攪拌下首先用質(zhì)量濃度為1.5%～3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；其次用質(zhì)量濃度為0.3%～1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；最后用質(zhì)量濃度為0.08%～0.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h換一次透析外液；

②將透析完的膠原溶液取出裝入截留分子量為一萬(wàn)的透析袋中，在磁力攪拌下用蒸餾水做透析外液，每12h換一次蒸餾水，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測(cè)沒(méi)有沉淀產(chǎn)生為止，獲得透析好的膠原溶液，整個(gè)透析過(guò)程都在室溫下進(jìn)行，透析外液的體積為內(nèi)液的8～12倍；

七、預(yù)凍：將透析好的膠原溶液注入不銹鋼盤(pán)模具中，然后室溫下靜置脫泡5～10h，再放入低溫冰箱中采用程序降溫，降溫速度為10℃/h，從常溫降溫至-50℃～-80℃并預(yù)凍12～24h，獲得預(yù)凍好的膠原溶液；

八、冷凍干燥：將預(yù)凍好的膠原溶液放入冷凍真空干燥機(jī)中，真空干燥36～72h，獲得冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿；

九、滅菌：將冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿裝入鋁箔袋中，用封口機(jī)封口，然后用⁶⁰Co進(jìn)行輻照滅菌，即完成高純度膠原蛋白海綿的制備；

其中步驟二中均勻間歇攪拌為每攪拌10h后停止0.5～1h。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟一中用1000ml質(zhì)量濃度為0.8%的碳酸鈉溶液浸泡12h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟二中將25g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入800ml質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸，攪拌使其溶解，然后加入500ml含有3.5g胃蛋白酶或者無(wú)花果蛋白酶的質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸，再置于5℃的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取3.5天。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟三中將提取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為-2℃，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分，離心30min。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟四中將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為10%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟四中加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為2mol/l，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4℃冰箱中靜置16h。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟五中將膠原混合液過(guò)濾，然后用蒸餾水清洗沉淀4次，再向過(guò)濾出的膠原沉淀中加入400ml的Tris-HCl緩沖溶液。