[發明專利]梯度溶氧發酵提高釀酒酵母超氧化物歧化酶產量的方法

無效

• 申請號: 201410022299.0
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103773742A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 王克文;孫愛君;郗宏波;黃福山;朱學金;張桂遠;胡森
• 申請（專利權）人: 中興能源（天津）有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明所屬微生物發酵工程技術領域，涉及一種提高釀酒酵母超氧化物歧化酶產量的發酵方法。?

背景技術

超氧化物歧化酶（Superoxide?Dismutase，簡稱SOD）是一類廣泛分布于各種生物體內的金屬酶，可以把有害的超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫和分子氧。根據SOD活性中心所結合金屬的不同，主要有Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，和Fe-SOD，其中以Cu/Zn-SOD最為常見，呈藍綠色，主要存在于真核細胞的細胞漿內。由于對超氧陰離子自由基的清除作用，SOD在臨床醫藥、食品工業、日化工業和農業上均有應有。?

SOD是目前生物學、醫學和生命科學領域中世界級的高、尖、精課題，目前世界范圍內的開發，大都從動物血里提取，多為Cu/Zn-SOD。典型的制備工藝是先經溶血，然后采用熱變性和有機溶劑處理提取，最后用柱層析純化【1】。動物血SOD的生產存在原料分散不易儲藏、動物疾病或動物血病毒的潛在風險，制約動物血SOD的生產。從植物中提取SOD是最近研究的熱點，植物SOD易被消費者接受，且植物原材料來源豐富，將成為SOD產品的主要來源。但是，植物SOD的生產必然會受到植物生長季節、氣候等因素的制約，且植物生長的周期性也會成為植物SOD生產的限制因素，加之植物的栽培管理，也會使得植物SOD的生產成本提高，迄今為止，國內市場上尚未見產業化大量生產的植物SOD，而市面流行的小量植物SOD樣品，純度低，色澤差，穩定性差，所以植物SOD的成功開發和利用還需要相當一段時間。?

相比之下，由于微生物具有原料易得，易于大規模培養的優勢，微生物發酵法生產SOD比動植物SOD的生產具有原料富足易儲備，不受生長季節限制等優勢。直到上世紀80年代，美國和日本才先后開發了發酵生產SOD的方法。目前，國內外都致力于微生物生產SOD的研究，并且在菌種選育、發酵工藝、分離提純、生理學研究、基因克隆表達及SOD應用等方面都取得了一定的研究進展【2】。對各種微生物SOD含量的研究結果顯示，真核微生物的SOD含量一般高于原核微生物。微生物SOD的提取經破壁、鹽析、透析、DEAE-纖維素層析純化幾個步驟進行。破壁方法有傳統的超聲波破壁法和工業上可行的氯仿破壁法【1】。但是，由于微生物發酵生產SOD最大的限制因素是SOD產量偏低，使得成本居高不下，難以實現工業化大生產，目前市面上流通的SOD仍然主要為動物血SOD產品，微生物發酵生產的重組人源SOD價格昂貴，不是普通人群所能消費。?

現有的微生物發酵生產SOD的研究，多數集中在誘變選育高產菌株或通過基因重組手段讓微生物大量表達外源SOD。誘變篩選菌株時間漫長、工作量大，基因工程的發酵產品涉及?到基因產品的安全性評價等方面，難以獲得批號進行工業化生產。而且不管是誘變菌株，還是基因工程菌株，最終要經過合適的發酵過程才能滿足高產SOD的需要。SOD是生物防御活性氧的酶，好氧微生物的SOD含量多于厭氧微生物SOD含量。對植物和藻類的研究表明，氧氣是誘導SOD形成的一個重要因子【3】。在微生物發酵過程中，人們往往更多注意培養基的營養成分、pH值和發酵溫度等因素對細胞生長和產量的影響，而忽略了發酵液氧氣含量對于微生物生產SOD的重要作用。因此，雖然發酵過程中養分充足，pH值和適宜溫度，但SOD的產量依然不能達到工業化生產的要求，因此不能將生產成本顯著降低，難以滿足普通人群的低價位需求。?

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種梯度溶氧發酵提高釀酒酵母超氧化物歧化酶產量的方法。?

本發明的技術方案概述如下：?

梯度溶氧發酵提高釀酒酵母超氧化物歧化酶產量的方法，包括如下步驟：?

1）菌種活化糖液準備：將濃度為15-25g/L葡萄糖水溶液，高壓滅菌15-25min，冷卻至室溫；?

2）發酵基礎培養基和補料液準備，其中：發酵基礎培養基：葡萄糖20-50g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母膏10-20g/L，KH₂PO₄0.3-1.0g/L，CuSO₄·5H₂O0.3-1.0g/L，ZnSO₄·7H₂O0.3-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O2-10g/L，余量為水，自然pH，121℃滅菌20-25min；補料液是20-50g/L葡萄糖水溶液；?