[發明專利]一種使用含金屬離子培養基生產含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法

有效

• 申請號: 201410021562.4
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103710401A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 陳衛;李敏;張白曦;陳海琴;趙建新;顧震南;田豐偉;王剛;張灝;陳永泉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C11B1/00;C11B1/10;C12R1/645
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

1.一種使用含金屬離子培養基生產含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A、平板活化培養

使用接菌環將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養基上，然后置于恒溫培養箱中在溫度20～32℃的條件下平板活化培養2～6天，得到平板培養物；

B、種子培養

使用接菌環挑取在步驟A平板活化培養的培養物接種到液體種子培養基中，然后置于試管中，在溫度20～32℃與150～250rpm的條件下培養40～52小時；

C、發酵培養

按照以發酵培養基體積計0.5%～2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養物轉接到pH4.5～8.5的液體發酵培養基中，置于發酵錐形瓶中在溫度20℃-25℃與150～250rpm的條件下震蕩培養35-40小時，當重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入生長穩定期，再添加終濃度為30g/L的乳化紅花籽油與10mM二價金屬離子溶液，該乳化紅花籽油含有以所述紅花籽油重量計0.1～1.0%乳化劑，接著在溫度28-32℃與150～250rpm的條件下震蕩培養48～100小時，得到一種發酵培養物，它在7500～8500rpm的條件下離心分離10～18分鐘，得到菌體與發酵上清液；

所述的菌體使用以重量計0.70～1.00%NaCl水溶液洗滌2～3次，得到的洗滌液與所述的發酵上清液合并，合并的發酵上清液用于后續處理；洗滌的菌體接著進行凍干；

D、由菌體提取脂肪

按照以mg計凍干菌體與以ml計8～12%鹽酸-甲醇溶液之比為20～50：0.5～1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8～12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45～-65℃的條件下進行甲酯化2.5～3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5～15分鐘，接著在5000～7000rpm的條件下離心分離2～5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作1～2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯；

E、由發酵上清液提取脂肪

按照以ml計發酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0～12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發酵上清液2～4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8～12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45～65℃的條件下進行甲酯化0.5～3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5～15分鐘，接著在3000～7000rpm的條件下離心分離2～5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復上述提取操作1～2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的平板固體培養基制備方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的pH調節至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115℃的條件下滅菌20min。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養基制備方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的pH調節至5.5，然后在溫度115℃的條件下滅菌20min。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的發酵培養基制備方法如下：

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的pH調節至4.5-5.5，然后在溫度115℃的條件下滅菌20min。

5.根據權利要求2-4中任一項權利要求所述的方法，其特征在于所述的無機酸選自硫酸或鹽酸；所述的無機堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述無機酸或無機堿水溶液的濃度是2.0～4.0mol/L。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的紅花籽油乳化液制備方法如下：

把紅花籽油添加到以重量計0.6%乳化劑水溶液中，直到紅花籽油的濃度達到150～250g/L，接著使用超聲設備在功率200W的條件下進行超聲處理4～6分鐘，再使用0.22μm無菌濾膜過濾除菌。