[發(fā)明專利]一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410021562.4
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103710401A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳衛(wèi);李敏;張白曦;陳海琴;趙建新;顧震南;田豐偉;王剛;張灝;陳永泉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C11B1/00;C11B1/10;C12R1/645
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 向華

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。?

【背景技術(shù)】

共軛亞油酸（Conjugatedlinoleicacid，CLA）即共軛十八碳二烯酸，是一組具有共軛不飽和雙鍵的亞油酸（LA）的位置和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。CLA的雙鍵在碳鏈上有多種位置排列方式，每個雙鍵可以以順式或反式構(gòu)型存在，其異構(gòu)體十分豐富。其中cis-9，trans-11-CLA（c9，t11-CLA）、trans-10，cis-12-CLA（t10，c12-CLA）兩種異構(gòu)體是含量最多并且確認具有生理活性功能的共軛亞油酸單體。近30年來，由于CLA具有包括抗癌、抗動脈粥樣硬化、免疫系統(tǒng)的調(diào)制以及抑制脂肪的積累等對人類健康有益的效果，而被廣泛的研究。?

因為CLA具有多種獨特的生理功能，被譽為“21世紀的新型營養(yǎng)素”，越來越多的引起了世界各國政府及科研工作者的重視，CLA正成為藥物、食品、飼料等研究領(lǐng)域的一個熱點。由于天然CLA主要存在于反芻動物乳制品中，含量非常低；而通過堿催化異構(gòu)化等化學(xué)方法合成的CLA是多種異構(gòu)體的混合物，較難分離純化具有活性功能的異構(gòu)體；所以，研究生物轉(zhuǎn)化法獲得成分單一的功能CLA具有重要的現(xiàn)實意義。?

到目前為止，c9，t11-CLA生物合成的最高量是Delacroixia?coronata菌株通過delta-9脫飽和酶作用將t-亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA，濃度最高達到10.5mg/ml，其中c9，t11-CLA的純度高達98%；而t10，c12-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心陳衛(wèi)研?究小組構(gòu)建的重組耶氏解脂酵母菌株（CCFM-JU277-9），通過添加20g/L的大豆油，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵38.5h得到CLA的最高產(chǎn)量為4g/L，其中全部為t10，c12-CLA。由于CCFM-JU277-9能夠在胞內(nèi)合成亞油酸異構(gòu)酶（PAI），并能夠分泌脂肪酶Lip2使培養(yǎng)基中以甘三酯形式存在的LA變?yōu)橛坞x的形式進入細胞，作為底物被PAI催化成專一的t10，c12-CLA單體形式，因此提高相關(guān)酶活性將有助于t10，c12-CLA產(chǎn)量的提高。CCFM-JU277-9合成t10，c12-CLA的產(chǎn)量仍具有提升空間。?

所以本發(fā)明希望通過控制發(fā)酵過程，確定影響t10，c12-CLA產(chǎn)量的發(fā)酵條件，從而實現(xiàn)提高t10，c12-CLA產(chǎn)量的目標(biāo)。?

【發(fā)明內(nèi)容】

[要解決的技術(shù)問題]?

本發(fā)明的目的是提供一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。?

[技術(shù)方案]?

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。?

本發(fā)明涉及一種使用含金屬離子培養(yǎng)基生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。?

所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下：?

A、平板活化培養(yǎng)?

使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20～32℃的條件下平板活化培養(yǎng)2～6天，得到斜面培養(yǎng)物；?

B、種子培養(yǎng)?

使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20～32℃與150～250rpm的條?件下培養(yǎng)40～52小時；?

C、發(fā)酵培養(yǎng)?

按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計0.5%～2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到pH4.5～8.5的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20℃-25℃與150～250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)35-40小時，當(dāng)重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進入生長穩(wěn)定期，再添加終濃度為30g/L的乳化紅花籽油與10mM二價金屬離子溶液，該乳化紅花籽油含有以所述紅花籽油重量計0.1～1.0%乳化劑，接著在溫度28-32℃與150～250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)48～100小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500～8500rpm的條件下離心分離10～18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；?

所述的菌體使用以重量計0.70～1.00%NaCl水溶液洗滌2～3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進行凍干；?

D、由菌體提取脂肪?