[發明專利]定量檢測EGFR基因突變的試劑盒及其用途

有效

• 申請號: 201410021377.5
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103710460A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 楊國華;何偉;李英輝;郭志偉
• 申請（專利權）人: 格諾思博生物科技南通有限公司;格諾思博生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種高靈敏度定量檢測EGFR基因突變的試劑盒及其用途。

背景技術

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，因其五年的存活率只有15%。肺癌主要分兩種類型：一類是非小細胞肺癌，另一類是小細胞肺癌。非小細胞肺癌(Non-small?cell?lung?cancer，NSCLC)占肺癌的75-80%。大部分中晚期NSCLC患者，采用全身化學藥物治療。而一些早期NSCLC患者可以采用手術或者局部放化療進行治療。然而傳統的化療方案在中晚期NSCLC治療中的療效并不令人滿意，且化療的不良反應大，患者難以耐受。因此新的治療方法急需開展。隨著生物技術的發展，靶向抗腫瘤藥物倍受關注。這些藥物針對性強，能特異性地殺傷腫瘤細胞。其中，表皮生長因子受體(EGFR)是目前腫瘤靶向治療，尤其是NSCLC治療的重要靶點。

臨床上通常采用小分子EGFR細胞內酪氨酸激酶抑制劑(epidermal?growth?factor?receptor?tyrosine?kinase?inhibitors，EGFR-TKIs)來選擇性抑制細胞內酪氨酸激酶的活化，中斷其下游的信號轉導，從而阻止腫瘤進展。EGFR-TKI靶向治療藥物代表有吉非替尼(Gefitinib，商品名為Iressa)和埃羅替尼(Erlotinib，商品名為Tarceva)。然而，在Gefitinib和Erlotinib的臨床試驗和臨床應用過程中，并不是所有的患者都受益，只有部分患者療效顯著。2004年，科學家發現了肺癌的EGFR基因突變，并且某些突變與Gefitinib和Erlotinib藥物的療效相關。香港中文大學的莫樹錦領導的IPASS研究以及同濟大學的周彩存教授牽頭的OPTIMAL研究顯示在EGFR敏感突變陽性的患者中，一線使用TKI藥物比傳統化療的患者無進展生存期(Progression?Free?Survival，PFS)顯著延長，表明在NSCLC患者的用藥治療選擇上，EGFR基因是否發生突變是一個重要的預測因子。

EGFR基因突變常集中在細胞內的酪氨酸激酶區域，突變率最高的是19外顯子的2種缺失突變(E746_A750del)和21外顯子的點突變(L858R)，前期研究顯示二者在所有EGFR基因突變中的比例占90%以上。這二者均屬于敏感突變，意味著TKI藥物的有效性。另外，臨床上對于TKI藥物有效的患者，在用藥后期均會產生耐藥性，研究顯示，其中50%患者是在19外顯子缺失或L858R等的敏感性突變的基礎上，又發生了第20外顯子790位密碼子的突變(T790M)，因此在臨床用藥選擇時，除敏感突變外，T790M耐藥基因的檢測也同樣重要。

目前常用的EGFR基因突變檢測方法有測序法和ARMS-PCR方法，這兩種方法均為定性檢測，存在一定的缺陷。測序法靈敏度較低約20%，且操作復雜，檢測時間較長，假陰性率較高。ARMS-PCR方法能夠達到1%的靈敏度，對于腫瘤組織樣本能夠滿足檢測需求，但是對于取樣方便的血液樣本，如血漿或者血液中的循環腫瘤細胞，腫瘤DNA含量往往低于1%，ARMS-PCR方法不足以對血液進行檢測。另外，最新研究表明，EGFR基因敏感突變的比例與靶向藥物療效關系密切，對于EGFR敏感突變比例較低的患者服用靶向藥，藥物的有效率會顯著降低，與未發生突變的人群類似。測序法和ARMS-PCR方法均為定性檢測，無法給出患者腫瘤組織中EGFR基因突變的比例，不足以判斷突變弱陽性患者是否能受益于TKI治療。

傳統的定性檢測僅能給出基因有無突變的信息，而無法判斷腫瘤的敏感突變比例，并且無法對血液樣本進行有效的檢測，局限了臨床醫生對靶向藥物療效的判斷。此外，在臨床用藥過程中產生的耐藥性突變，以前的方法由于靈敏度不夠也無法進行檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高靈敏度定量檢測EGFR基因突變的試劑盒及其用途。

在本發明的第一方面，提供一種檢測(較佳地為定量檢測)基因突變的試劑盒，所述試劑盒中包括：

(1)特異性擴增基因突變位點區域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物擴增包含基因突變位點在內的擴增產物的長度為50-100bp(較佳地60-80bp)；前引物與突變型基因位點及附近序列完全互補，長度為10-20bp(較佳地12-18bp；更佳地12-16bp)；和

(2)特異性針對擴增產物的探針，所述的探針攜帶可檢測標記。