[發明專利]定量檢測EGFR基因突變的試劑盒及其用途

有效

• 申請號: 201410021377.5
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103710460A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 楊國華;何偉;李英輝;郭志偉
• 申請（專利權）人: 格諾思博生物科技南通有限公司;格諾思博生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種檢測基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括：

(1)特異性擴增基因突變位點區域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物擴增包含基因突變位點在內的擴增產物的長度為50-100bp；前引物與突變型基因位點及附近序列完全互補，長度為10-20bp；和

(2)特異性針對擴增產物的探針，所述的探針攜帶可檢測標記。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，當EGFR基因突變為點突變時，所述的試劑盒中還包括：

(3)靶向點基因突變位點對應的野生型位點的競爭性Block寡聚核苷酸，其與野生型基因完全互補，而與突變基因部分互補；較佳的，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修飾的。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，靶向基因突變位點對應的野生型位點的競爭性Block寡聚核苷酸中，突變位點位于中間。

4.如權利要求1-3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒定量檢測EGFR基因突變，包括：

(a)組試劑：檢測EGFR第21外顯子的點突變：前引物SEQ?ID?NO:9或SEQ?ID?NO:10，后引物SEQ?ID?NO:12，探針SEQ?ID?NO:13，Block寡聚核苷酸SEQ?ID?NO:15；

(b)組試劑：檢測EGFR第20外顯子790位的點突變：前引物SEQ?ID?NO:23，后引物SEQ?ID?NO:24，探針SEQ?ID?NO:25，Block寡聚核苷酸SEQ?ID?NO:27；

(c)組試劑：檢測EGFR第19外顯子缺失突變：前引物SEQ?ID?NO:30，后引物SEQ?ID?NO:31，探針SEQ?ID?NO:32；

(d)組試劑：檢測EGFR第19外顯子缺失突變：前引物SEQ?ID?NO:33，后引物SEQ?ID?NO:34，探針SEQ?ID?NO:32；和

(e)組試劑：檢測EGFR保守區域拷貝數：前引物SEQ?ID?NO:3，后引物SEQ?ID?NO:4，探針SEQ?ID?NO:5；

較佳地，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修飾的。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，(a)組試劑中，前引物濃度500±200nM，后引物濃度500±200nM，探針濃度100±40nM，Block寡聚核苷酸濃度1500±600nM；

(b)組試劑中，前引物濃度500±200nM，后引物濃度500±200nM，探針濃度100±40nM，Block寡聚核苷酸濃度1500±600nM；

(c)組試劑中，前引物濃度500±200nM，后引物濃度500±200nM，探針濃度100±40nM；

(d)組試劑中，前引物濃度500±200nM，后引物濃度500±200nM，探針濃度100±40nM；或

(e)組試劑中，前引物濃度500±200nM，后引物濃度500±200nM，探針濃度100±40nM。

6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括：TaqDNA聚合酶，鎂離子，dNTP，擴增緩沖液，梯度校準品。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，每一組所述前引物、后引物、探針、Block寡聚核苷酸分別與所述Taq?DNA聚合酶，鎂離子，dNTP混合于一個體系中；或

所述的梯度校準品與所述前引物、后引物、探針、Block寡聚核苷酸及TaqDNA聚合酶，鎂離子，dNTP混合于一個體系中。

8.權利要求1-7任一所述的試劑盒的用途，用于檢測基因突變。

9.一種檢測基因突變的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i)以待測基因為模板，以權利要求1-7任一所述的試劑盒中的試劑進行PCR擴增；

(ii)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中待測基因的突變類型。

10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的試劑盒定量檢測EGFR基因突變；并且，步驟(ii)包括：

(S1)利用(a)、(b)、(c)和(d)組試劑分別檢測第21外顯子的點突變拷貝數、第20外顯子790位的點突變拷貝數、第19外顯子缺失突變拷貝數；

(S2)利用(e)組試劑檢測EGFR保守區域拷貝數：

(S3)將(S1)獲得的各組突變拷貝數與(S2)中獲得的保守區域拷貝數比較，獲得EGFR基因各突變位點的突變比例。