[發(fā)明專利]一種奶牛酮病診斷試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410020569.4
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103792230A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張志剛;姜惠潔;王明河;張偉倩;姜婧;陳雁;楊大千;于洪祥;趙樹臣;王洪斌
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸醫(yī)臨床診斷學(xué)領(lǐng)域，涉及一種奶牛酮病診斷試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

酮病是圍產(chǎn)期奶牛的重要的營養(yǎng)代謝性疾病，具有發(fā)病率高、群發(fā)性的特點(diǎn)。妊娠母牛分娩后，采食量下降，同時(shí)泌乳量迅速增加，奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，引起奶牛酮病的發(fā)生。奶牛酮病的主要特點(diǎn)是乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮含量升高和血葡萄糖含量降低。近年來，由于高產(chǎn)奶牛品種的引進(jìn)和繁育、高能飼料的開發(fā)、使用，集約化飼養(yǎng)管理的普及等方面的因素，使得奶牛酮病的發(fā)病率日益升高。酮病奶牛的產(chǎn)奶量顯著降低，且容易繼發(fā)脂肪肝、子宮內(nèi)膜炎、生產(chǎn)癱瘓、乳腺炎和胎衣不下等疾病，提高了奶牛的淘汰率，導(dǎo)致的診療及產(chǎn)奶量降低等經(jīng)濟(jì)損失比較巨大。據(jù)報(bào)道，中國奶牛酮病的發(fā)病率占泌乳牛的20-30％，嚴(yán)重制約我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

根據(jù)是否出現(xiàn)臨床癥狀，常將酮病分為臨床酮病和亞臨床酮病。在大多數(shù)臨床病例中，酮病的臨床綜合癥與病牛血液酮體水平存在較高的相關(guān)性奶牛酮病的主要代謝障礙是低血糖和高酮(乳酮、尿酮和血酮)體，并共同引發(fā)酮病的臨床癥狀。臨床酮病是指病牛出現(xiàn)了明顯的損害健康的癥狀，使管理人員認(rèn)為有必要進(jìn)行下一步的診斷調(diào)查，對經(jīng)實(shí)驗(yàn)室或牛旁檢測酮體升高的病例進(jìn)行治療。臨床癥狀包括產(chǎn)奶量顯著降低、采食減少、糞便干燥和體重降低。另一方面，亞臨床酮病指奶牛體內(nèi)酮體含量超過閾值，但無明顯臨床癥狀。由于亞臨床酮病不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，監(jiān)控項(xiàng)目開展時(shí)必須對看似健康的牛進(jìn)行檢測，以檢出亞臨床酮病奶牛。血液、尿液和乳汁中酮體含量升高，但不表現(xiàn)臨床癥狀的稱為亞臨床酮病，相比較于臨床酮病，亞臨床酮病給奶牛帶來更大的經(jīng)濟(jì)損失。大量的研究結(jié)果表明，亞臨床酮病在高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后2-8周廣泛存在，發(fā)病率在8-36％之間。

奶牛亞臨床酮病的診斷主要依靠檢測血液中的酮體含量來實(shí)現(xiàn)，在規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場，采集牛的血液工作量大，耗時(shí)費(fèi)力，且需要的儀器設(shè)備要求高，檢測成本也較高，針對我國實(shí)際國情，目前仍難以大范圍普及使用。此外，采集血液本身對奶牛是一種應(yīng)激反應(yīng)，存在一定的損傷，而對于奶牛酮病，需要常態(tài)化的定期監(jiān)控，常態(tài)化的采集血液會導(dǎo)致奶牛各方面的應(yīng)激反應(yīng)。而相較于采集血液，采集牛乳則非常方便、經(jīng)濟(jì)，在每日榨乳時(shí)使用試管即可收集，且不會對奶牛產(chǎn)生應(yīng)激和損傷。酮體包括乙酰乙酸、丙酮和β-羥丁酸，在乳汁中β-羥丁酸的含量最高且性質(zhì)穩(wěn)定，因此，檢測乳汁β-羥丁酸的含量實(shí)現(xiàn)奶牛亞臨床酮病的診斷最為可行。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于建立一種使用牛乳檢測奶牛酮病的試劑盒，以便更快速準(zhǔn)確檢測奶牛酮病。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種奶牛酮病診斷試劑盒，包括檢測器、3種試劑和標(biāo)準(zhǔn)比色板檢測試劑，檢測器上開有多個(gè)加樣孔，檢測器的一端設(shè)置有凹槽，檢測器的另外一端為手持端，試劑1為心肌黃酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羥丁酸脫氫酶的混合物，按質(zhì)量比為2∶2∶1混合；試劑2為二甲基亞砜、磷酸氫二鈉、氯化鎂、疊氮鈉和亞硝酸鈉的混合溶液，二甲基亞砜質(zhì)量濃度為0.1％，疊氮鈉的質(zhì)量濃度為0.01％、亞硝酸鈉的質(zhì)量濃度為0.01％，磷酸氫二鈉的質(zhì)量濃度為1％，氯化鎂的質(zhì)量濃度為1％；試劑3為噻唑藍(lán)溶液，質(zhì)量濃度為0.2％。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特點(diǎn)：

1、所述的標(biāo)準(zhǔn)比色板為1個(gè)白色區(qū)間和3個(gè)紫色區(qū)間，其中3個(gè)紫色區(qū)間隨酮濃度增加，從左至右顏色逐漸加深；4個(gè)顏色區(qū)間分別對應(yīng)的結(jié)果為正常，弱陽，中陽和強(qiáng)陽。

2、本試劑盒采用奶牛乳汁檢測。

3、一種以非診斷為目的檢測奶牛酮病的檢測方法：

步驟一、乳汁酮體分離的方法為：將新鮮采集的奶牛乳汁收集于離心管中，按體積比3∶1∶1∶1，加入質(zhì)量濃度為50％高氯酸、質(zhì)量濃度為37％鹽酸、質(zhì)量濃度為98％硫酸和質(zhì)量濃度為65％硝酸，16500r／min離心15-20min，收集上清液待測；

步驟二、取200mg試劑1，加入到20mL試劑2中混合均勻，將試劑1和試劑2的混合液加入到檢測器的加樣孔中，每孔加入50μL，再加入20μL試劑3，充分混勻，最后加入50μL乳汁上清液樣品；所述的試劑1為心肌黃酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羥丁酸脫氫酶的混合物，按質(zhì)量比為2∶2∶1混合；試劑2為二甲基亞砜、磷酸氫二鈉、氯化鎂、疊氮鈉和亞硝酸鈉的混合溶液；二甲基亞砜質(zhì)量濃度為0.1％，疊氮鈉和亞硝酸鈉的質(zhì)量濃度為0.01％，磷酸氫二鈉，氯化鎂的質(zhì)量濃度為1％；試劑3為噻唑藍(lán)溶液，質(zhì)量濃度為0.2％；