[發(fā)明專利]一種流腦疫苗及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410020295.9
• 申請(qǐng)日: 2014-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN103721249A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔曉峰;馬小偉;許項(xiàng)可;潘若文;安文琪;范蓓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華蘭生物工程股份有限公司;華蘭生物疫苗有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/116
• 分類號(hào): A61K39/116;A61P31/04;A61K39/095
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種四價(jià)流腦多糖疫苗及其制備方法及工藝。

背景技術(shù)

流行性腦脊髓膜炎，是由腦膜炎雙球菌感染腦膜或者腦脊髓膜引起的呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)主要有高燒、頭痛、噴射狀嘔吐、脖子發(fā)硬。也可引起敗血癥，皮膚出現(xiàn)紫色淤血、瘀斑，腦膜炎會(huì)引起腦部損傷而遺留聽力下降或耳聾、智力低下等后遺癥。病死率在5%～10%。流腦冬春季節(jié)病例高發(fā)，一般11～12月份病例開始增多，第二年的2～5月份為發(fā)病高峰期。該病是發(fā)病率高，危險(xiǎn)性大，是嚴(yán)重危害兒童健康的傳染病。流行性腦脊髓膜炎（流腦）和敗血癥是由多種血清群的腦膜炎奈瑟菌引起的，本病在全球呈地方性流行，主要由A群、B群或C群腦膜炎球菌引起，但Y群也變得越來越重要，至少在美國部分地區(qū)如此。A群腦膜炎球菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲“流腦流行帶”，每隔7～14年就會(huì)出現(xiàn)一次較大流行，引起兒童和年輕成人超額發(fā)病率與死亡率。近年來，這些地區(qū)及沙特阿拉伯也出現(xiàn)過W135群導(dǎo)致的流腦爆發(fā)，一些西方國家則出現(xiàn)過C群引起的流腦爆發(fā)。即使是在醫(yī)療條件比較完善的地方，流腦病死率仍然很高（5%～15%）。一般來說，僅靠藥物預(yù)防措施來控制此病是不夠的。

目前主要采取注射流腦疫苗的方式來預(yù)防流行性腦脊髓膜炎。我國主要接種A群腦膜炎多糖疫苗和/或AC群腦膜炎多糖疫苗為主，研制多價(jià)疫苗和聯(lián)合疫苗是疫苗發(fā)展方向，但是疫苗中的非主要成分的疊加又會(huì)帶來副反應(yīng)大的問題，如何有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素是其中最為突出的難題。細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌的細(xì)胞壁成分之一，是一種脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），LPS是腦膜炎球菌感染的主要致病物質(zhì)，進(jìn)入人體能引起機(jī)體發(fā)熱，又稱為熱原質(zhì)。按照現(xiàn)有的腦膜炎多糖疫苗的細(xì)菌內(nèi)毒素藥典標(biāo)準(zhǔn)，大部分人接種疫苗只有非常輕微的發(fā)熱反應(yīng)，但是個(gè)別人會(huì)因此出現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)熱反應(yīng)。因此，去除流腦多糖中的細(xì)菌內(nèi)毒素，減少疫苗不良反應(yīng)，是研制多價(jià)疫苗和聯(lián)合疫苗，提高疫苗品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種四價(jià)流腦疫苗及其制備方法和工藝。

本發(fā)明所提供的流腦疫苗，由A群腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria?meningitidis）發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、乳糖和水組成；

其中，A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，乳糖在疫苗中的濃度為5mg/ml～10mg/ml。

上述流腦疫苗可按照如下方法制備。

本發(fā)明所提供的流腦疫苗的制備方法，包括如下步驟：

（1）分別發(fā)酵A群腦膜炎奈瑟氏球菌、C群腦膜炎奈瑟氏球菌、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌，得到的發(fā)酵液依次記作A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液、W135菌發(fā)酵液；

（2）分別從A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液、W135菌發(fā)酵液中分離多糖，將得到的多糖依次記作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖；

（3）將A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用QSepharoseFF瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析，收集洗脫峰，即分別得到由A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖；

（4）將由A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、乳糖和水按照權(quán)利要求1中所述濃度進(jìn)行混合，即得到流腦疫苗。

上述制備方法中，所述步驟（3）中，用QSepharoseFF瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析的方法中，上樣的樣品為分別將步驟（2）得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用水溶解后得到的多糖濃度為10～20mg/ml的溶液，洗脫液為生理鹽水，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為206nm，收集第一峰。

上述制備方法中，在所述柱層析之后，還包括如下超濾脫鹽步驟：將柱層析收集的樣品用截留分子量為100kD的膜包，用10～20倍體積水進(jìn)行洗濾脫鹽。