[發明專利]一種流腦疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201410020295.9
• 申請日: 2014-01-16
• 公開（公告）號: CN103721249A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 崔曉峰;馬小偉;許項可;潘若文;安文琪;范蓓
• 申請（專利權）人: 華蘭生物工程股份有限公司;華蘭生物疫苗有限公司
• 主分類號: A61K39/116
• 分類號: A61K39/116;A61P31/04;A61K39/095
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

1.一種流腦疫苗，由A群腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriameningitidis）發酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖、乳糖和水組成；

其中，A群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，C群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μg/ml～130μg/ml，乳糖在疫苗中的濃度為5mg/ml～10mg/ml。

2.根據權利要求1所述的流腦疫苗，其特征在于：所述流腦疫苗按照如下權利要求3～9中任一所述方法制備。

3.一種制備權利要求1中所述流腦疫苗的方法，包括如下步驟：

（1）分別發酵A群腦膜炎奈瑟氏球菌、C群腦膜炎奈瑟氏球菌、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌，得到的發酵液依次記作A菌發酵液、C菌發酵液、Y菌發酵液、W135菌發酵液；

（2）分別從A菌發酵液、C菌發酵液、Y菌發酵液、W135菌發酵液中分離多糖，將得到的多糖依次記作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖；

（3）將A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用Q?Sepharose?FF瓊脂糖凝膠進行柱層析，收集洗脫峰，即分別得到由A群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖；

（4）將由A群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發酵得到的多糖、乳糖和水按照權利要求1中所述濃度進行混合，即得到流腦疫苗。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）中，用Q?SepharoseFF瓊脂糖凝膠進行柱層析的方法中，上樣的樣品為分別將步驟（2）得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用水溶解后得到的多糖濃度為10～20mg/ml的溶液，洗脫液為生理鹽水，監測波長為206nm。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步驟（2）中，從發酵液中分離多糖的方法包括如下步驟：

1）分別去除A菌發酵液、C菌發酵液、Y菌發酵液和W135菌發酵液中的菌體；

2）為如下a）和/或b）：

a）、用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀去除菌體的A菌發酵液或去除菌體的C菌發酵液中的多糖，分別收集沉淀；

b）、先用截留分子量為30kD的超濾膜分別對去除菌體的Y菌發酵液或去除菌體的W135菌發酵液進行超濾濃縮，得到Y菌濃縮液或W135菌濃縮液；再用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀Y菌濃縮液或W135菌濃縮液中的多糖，分別收集沉淀；

3）、用氯化鈣分別將步驟2）所得沉淀中的多糖與十六烷基三甲基溴化銨解離，得到解離液；

4）、用95%乙醇水溶液分別去除步驟3）的解離液中的雜質，收集上清液；

5）、用95%乙醇水溶液分別從步驟4）的上清液中沉淀多糖，收集沉淀；

6）、依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌步驟5）所得沉淀；

7）、分別將步驟6）洗滌后沉淀進行干燥；

8）、將步驟7）所得干燥后沉淀用1:10飽和中性醋酸鈉水溶液溶解，分別得到粗糖溶液，依次記作A菌粗糖溶液、C菌粗糖溶液、Y菌粗糖溶液、W135菌粗糖溶液；

9）、用酚分別對步驟8）所得粗糖溶液進行提取，棄去中層及酚層，收集上層液；

10）、用氯化鈣水溶液分別對步驟9）所得上層液進行透析，收集透析后的溶液；

11）、用95%乙醇水溶液分別對步驟10）所得透析后的溶液進行沉淀，收集沉淀；

12）、依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌步驟11）所得沉淀；

13）、分別將步驟12）洗滌后沉淀進行干燥，分別得到A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖。